タンパク質医薬品は、その不均一な性質のため、広範な特性解析が必要になります。ペプチドマップは、タンパク質や複数の処理で得られる最終生成物のフィンガープリントで、分析対象のタンパク質を包括的に理解することができます。 再現性と信頼性の高いペプチドマッピングおよび翻訳後修飾（PTM）分析は、困難な場合があります。ペプチドマッピングは、タンパク質の分離と精製、ペプチド結合の選択的切断、ペプチドのクロマトグラフィー分離、有効な手法によるペプチドの分析という 4 つの主要な手順で構成されています。サンプル前処理は煩雑な場合があり、ばらつきをもたらす可能性があります。さらに、ペプチドや PTM は多様で低濃度であるため、検出と定量は困難な場合があります。アジレントは、システム、消耗品、ソフトウェア、サービスの幅広いポートフォリオをシームレスに連携させ、ペプチドマッピングおよび PTM 分析を自動化および簡略化して、信頼できる高品質の結果を提供することにより、これらの課題を克服するのを支援します。
自動化された LC/Q-TOF の反復 MS/MS ワークフローにより、メソッド最適化と PTM 分析を簡略化し、存在量の少ないペプチドに対する感度を向上させることができます。
分析の潜在能力を最大限に引き出します。合成ペプチド、タンパク質消化、高度なクロマトグラフィー技術、および質量分析技術をご紹介します。
ペプチドマッピングのためのサンプル前処理には、通常、酵素による消化、クリーンアップ、場合によってはフラクショネーションを含む、複雑な一連のステップが必要になります。タンパク質およびペプチド分析のための自動サンプル前処理プラットフォームである Agilent AssayMAP Bravo は、事前に最適化されたプロトコルによりこの煩雑なプロセスを自動化し、分析を簡略化すると同時に再現性を向上させます。
Agilent LC、カラム、消耗品は、バイオ分析とラボ効率のために最適化されています。Agilent Infinity III Bio LC システムは、バイオイナートで生体適合性のある流路を備えており、手間のかかる手動プロセスを簡略化するように設計されたスマートなツールを装備しています。アジレントのペプチド分離カラムは、優れたピーク性能を実現するように設計されており、アジレントの消耗品および標準と連携して堅牢な結果を提供します。
ペプチドおよび PTM は多様であり、低濃度で存在する可能性があるため、検出と定量が困難です。Agilent 6545XT LC/Q-TOF は、非常に効率の高い ExD セルを搭載しており、6545XT LC/Q-TOF の機能に電子捕獲解離（ECD）を追加することにより、ペプチドおよびタンパク質分析における性能を最大限に高めます。Agilent MassHunter Bioconfirm ソフトウェアにより、配列カバー率を迅速に確認できます。
Agilent Altura ZORBAX Eclipse Plus C18 イナートカラムは、ペプチドマッピングワークフローにおいて優れた性能を発揮します。Altura カラムは、従来のステンレス製ハードウェアとは異なり、特に疎水性ペプチドや修飾ペプチドにおいて、ピーク形状、再現性、分解能を向上させます。このイナートカラムは、合成モノクローナル抗体ペプチドおよびトリプシン消化ハーセプチンの LC/MS 分析において、翻訳後修飾の信頼性の高い同定を可能にし、脱アミド化ペプチドのピーク形状と分解能を顕著に向上させます。また、このカラムは、脱アミド化変異体を高精度で分離する能力により、高い感度と精度が要求されるバイオ医薬品アプリケーションにおいて、きわめて有用なツールとなります。
Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF を用いて、トラスツズマブのトリプシン消化物を分析する手法をご紹介します。3 回の繰り返し分析において、98 %、99.7 %、98 % の配列カバー率が得られました。MS1 シグナルが低～1e4 範囲のペプチドについて、優れたシーケンスラダーが示されています。脱アミド化ペプチド FTISADTSKNTAYLQMNSLR に関する情報も示されており、脱アミド化部位が 17 番位置に明確に割り当てられています。
ペプチドマッピングは、バイオ医薬品業界に不可欠です。サンプルが複雑であるため、高分解能と堅牢なペプチドマッピングメソッドの重要性が増しています。このアプリケーションノートでは、Agilent 熱平衡化デバイス（TED）と Agilent 1290 Infinity III Bio LC システムの組み合わせで実現できる、高温での分解能と堅牢性について説明します。
Agilent 1290 Infinity III Bio LC システムと Agilent 6495 トリプル四重極 LC/MS システムは、ペプチドの定量分析に最適なプラットフォームです。リガンド結合アッセイ（ligand binding assay：LBA）/LC/MS のハイブリッドワークフローは両方の技術の利点を組み合わせたもので、アッセイの感度と再現性が非常に優れています。このアプリケーションノートでは、高感度な LBA/LC/MS ハイブリッドワークフローを用いた、生体マトリックスからのトラスツズマブサロゲートペプチドの定量分析について説明します。このワークフローのもう 1 つの利点は、汎用性と特異性が高く、その他の多くの mAb 治療薬に適用できることです。またメソッド開発時間が非常に短いため、創薬と医薬品開発に最適です。
グルタミンとアスパラギンの脱アミド化は、タンパク質に影響を与える最も一般的な分解の 1 つです。ただし、質量分析による脱アミド化の分析は、未修飾型に対するマスシフトが 1 Da 未満と小さいために困難です。部位特異的な脱アミド化の測定には、LC/MS 分析の前のプロテアーゼ消化がよく使用されますが、未修飾型と脱アミド化型がクロマトグラフィー分離されなければ、この方法も失敗する可能性があります。電荷表面を持つ Agilent AdvanceBio ペプチドプラス逆相 C18 カラムを使用すれば、脱アミド化ペプチドとその未修飾変異体の分離度が劇的に向上します。また移動相の最適化によって、これらの成分の分離度をさらに制御しやすくなる可能性があります。
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