オリゴヌクレオチドの合成では、さまざまな不純物が生成される可能性があります。製造バッチには、ターゲット配列と、密接に関連する破損配列の両方が含まれています。オリゴヌクレオチドの精製により、ターゲットのオリゴヌクレオチドを不純物から単離して、詳細な研究に必要な純度を確保します。アジレントは、複数の分取スケール形式によるオリゴヌクレオチド精製の最適化を支援する、包括的なソリューションポートフォリオを提供しています。これらは、分析からセミ分取および分取スケール LC システムまでの範囲にわたっており、複数の検出器およびフラクションコレクションオプションと組み合わせることができます。
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合成オリゴヌクレオチドの開発に伴い、その特性解析のための堅牢な分析メソッドと使いやすいデータ解析ワークフローに対するニーズが生じています。包括的なワークフロー、実績のあるメソッドをご紹介します。また、多様なオリゴヌクレオチド分析ワークフローの促進に役立つリソースを豊富にご用意しています。
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合成オリゴヌクレオチドの精製には、他にはない困難さがあります。全長生成物の合成に関連する不純物には、切断、不完全なチオール化、塩基欠損を示す分子が含まれている場合があります。精製メソッドを開発する際には、このような構造を考慮する必要があります。アジレントは、高分解能イオンペア逆相（IP-RP）ベンチトップ精製ワークフローを用いてメソッド開発を簡略化し、スケールアップを効率化するのを支援します。
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アプタマなどの合成オリゴヌクレオチド、低分子干渉 RNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドは通常 100 nt 未満の鎖長であるため、分取 LC および LC/MS ソリューションを使用して精製することが可能です。アジレントは、システム、消耗品、ソフトウェア、サービスを含む、オリゴヌクレオチド精製のための包括的なワークフローソリューションを提供します。
HPLC によるオリゴヌクレオチド精製は、分析を妨げる可能性のある関連不純物を除去することにより、純度を大幅に向上させる一般的な技法です。最も一般的に使用される技法は、アニオン交換クロマトグラフィーまたはイオンペア逆相（IP-RP）クロマトグラフィーです。これらの技法で生成されるフラクションは、高濃度の塩および高濃度のバッファ、またはイオンペア試薬を含む溶液をもたらします。バッファ交換の実施、塩濃度の低減、またはイオンペア試薬の除去を目的とした、このようなフラクションの脱塩にきわめて効果的なメソッドは、遠心分離ゲルろ過装置を使用する手法です。Agilent AdvanceBio スピンカラムは、エタノール沈殿などの他の従来技術と比較して、高速で効果的です。
100 ヌクレオチド未満の合成オリゴヌクレオチドは通常、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用して分析・精製されます。選択性をさらに向上させるには多くの場合、質量選択検出器（MSD）が用いられますが、この手法には、ヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）などの高純度で高価な試薬が必要とされます。このアプリケーションノートでは、ジブチルアミン（DBA）とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）に基づく精製メソッドについて説明します。このメソッドでは、MSD シグナルによってトリガーされるフラクションコレクションも可能です。ソフトウェアサポートと、表面多孔質粒子が充填された Agilent AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラムを用いることで、従来のメソッドと比較して、ターゲット化合物をより迅速かつ高純度で収集できました。
移動相の組成は、オリゴヌクレオチドのクロマトグラフィー分離において重要な役割を果たします。重要なのは、有機溶媒の使用や高温での使用により、分離効率が大幅に向上する可能性があるということです。pH がより高い移動相緩衝液を使用すると、より短いオリゴヌクレオチドのピーク形状が改善される可能性がありますが、より長いオリゴヌクレオチドは、生成物が pH を介して分解してしまう可能性があります。したがって、精製に関連する分解が引き起こされる前に、使用する最高温度と pH の組み合わせを決定するために、オリゴヌクレオチド製品をモニタリングする必要があります。このようなメソッドにより、Agilent PL-SAX カラムを用いたオリゴ分離を最適化するための体系的なアプローチを実証しました。また、本研究では、オリゴヌクレオチドの SAX 分取を実施して、イオンペア（IP）-逆相（RP） LC/UV および LC/MS メソッドにより、サンプル純度を確認するためのワークフローも示しています。
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