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PfuUltra ホットスタート DNAポリメラーゼとPCR マスターミックス
掲載の製品はすべて試験研究用です。診断目的にご利用いただくことはできません。
PfuUltra ホットスタート DNAポリメラーゼ*,‡は、 Pfu DNAポリメラーゼに遺伝子操作を加えた変異型で、校正機能が極めて高いPCR酵素、PfuUltra High-Fidelity DNAポリメラーゼの高いパフォーマンスを維持したまま特異性が高められてた酵素です。PfuUltra High-Fidelity DNAポリメラーゼとTaq DNAポリメラーゼの正確性を、論文でも報告されている検定法を用いて比較したところ、PfuUltra High-Fidelity DNAポリメラーゼの平均エラー率が Pfu DNAポリメラーゼよりも3倍低く、Taq DNAポリメラーゼよりも18倍低いことが明らかになりました1。PfuUltra High-Fidelity DNAポリメラーゼは極めて正確性の高い酵素と言えます。
極めて高い正確性に加えて、PfuUltraホットスタートDNAポリメラーゼにはアジレント(旧ストラタジーン)で独自に開発したArchaeMaxx Polymerase-Enhancing Factorが含まれており、高い増幅性能と伸張性能を兼ね備えています。PCRの反応中にdCTP脱アミノ化によって生成したdUTPが、Pfu やその他多くの古細菌性の校正機能をもつポリメラーゼの働きを抑制し、酵素の効率を低下させる現象が知られています3。ArchaeMaxx Polymerase-Enhancing FactorはdUTPを分解して、PCR反応を阻害しないdUMPと無機ピロリン酸にするため、増幅性・伸張性を改善し、PCR反応のパフォーマンスを全体として大幅に向上させます。
Pfu DNAポリメラーゼと同様にPfuUltraホットスタートDNAポリメラーゼによる増幅産物は平滑末端で、StrataClone Blunt PCR Cloning Kitなど平滑末端用のクローニングキットを用いたクローニングに理想的です。正確性の高い酵素をクローニングに用いることで、正しいクローンを選択するためにシーケンシングを行うクローンの数を減らすことが可能で、最小限の時間、労力で実験を行うことができます。PfuUltra High-Fidelity DNAポリメラーゼを使用した場合 500-bp のフラグメントを増幅の際にエラーが起こる可能性はわずか 0.5% 以下になります。
増幅効率は一回のPCRサイクルあたりの fold amplification の測定値であり、完璧な倍加と比較した時の割合あるいはパーセンテージとして表現されます(完璧な倍加のPCRは 100％ の増幅効率を示します)。PCR効率を一度測定すれば、特定の鋳型の量から fold amplification を測定したり、あるいは、希望する収量を得るために必要なPCRサイクル数の計算をすることに利用できます。増幅効率の小さな変化はPCRのサイクル中に増幅され、最終産物の収量の変化は著しいものとなります。例えば、25-サイクルのPCRでは、5% の増幅率向上が二倍の最終産物収量の増加となります。†効率の低い反応は収量が少なくなるだけではなく、効率の高い反応よりも飽和状態になるまでに長い時間がかかります。このため、プライマー・ダイマーや望ましくない副産物が増幅される機会が増えてしまいます。リアルタイムQPCR方法を使用した解析では、PfuUltra ホットスタート DNAポリメラーゼは他のプルーフリーディング ポリメラーゼよりも高い増幅効率を示すことが明らかになりました4。
PfuUltraホットスタートDNAポリメラーゼは特異性が向上し、またバックグラウンドが減少し、困難なPCRの収量を向上します。ホットスタート仕様にはモノクローナル抗体が含まれており、サイクリングが始まるまでDNA ポリメラーゼと3'-5'エクソヌクレアーゼ活性を抑制します。PfuUltraホットスタートDNAポリメラーゼは複雑なゲノムDNAから低コピー数のターゲットを増幅するときやPCR反応を室温で長時間放置するときに理想的です。
PfuUltra ホットスタート PCR マスターミックスは便利な2×仕様で、 PfuUltra ホットスタートDNAポリメラーゼ、最適化された反応バッファー、MgCl2 、dNTPが含まれています。PfuUltra PCR マスターミックスを使用することで、貴重な時間を節約し、ハイスループットを実現するだけではなく、ピペッティング回数を削減することでクロス‐コンタミネーションを最小限に抑えます。 また、どんなPCR酵素よりも高いフィデリティを提供しつつ、サンプル間で一貫した結果が得られます。
†増幅効率は実験的な fold amplification を測定する時に以下の公式を用いて求められます。 N/N0=(1+E)n N0 = 最初の分子数、N = 増幅された分子数、 E = 効率 そして n = PCRサイクル数
§cDNAの増幅ではMg2+の終濃度を 2 mM から 3 mM へ上げる必要がある場合もあります。
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1. Cline, J., Braman, J.C. and Hogrefe, H.H. (1996), Nucleic Acids Res. 24: 3546-3551
2. Hogrefe, H., et al. (2002), Proc Natl. Acad. Sci. USA 99: 596-601
3. Fogg, et al. (2002), Nat Struct Biol. 9(12): 922-927
4. Arezi, B., et al. (2003), Anal. Biochem. 321:226-235
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