HaloPlex とは

     

View video従来のカスタムアンプリコンシーケンスを凌駕する新技術

イルミナプラットフォーム  ターゲット領域 最大 5 Mb に拡大
 Ion PGM 対応キット ターゲット領域 最大 2.5Mb に拡大

HaloPlex ターゲットエンリッチメントシステムは、ヒトゲノム領域をターゲットとしたエンリッチメントを、シンプルなプロトコルで 8時間以内(500 kb より大きな領域をターゲットとする場合には 20時間程度) に行う画期的な技術です。ターゲット領域は最大 5 Mb まで拡張可能で、デスクトップシーケンサーの能力を最大限に活かし、多数のサンプルを迅速に効率よく解析することができます。Webベースのデザインウィザード (無料) を使って、数千以上のエクソンを含むパネルのカスタムデザインを簡単に作成することができます。

ハイブリダイゼーションの選択性と PCR のスピードを融合させた革新的な技術により、シングルチューブで 200,000以上のアンプリコンを増幅することが可能になりました。サンプル DNA の超音波による断片化は不要で、専用の機器の導入も不要です。出来上がったライブラリはすぐにシーケンス解析に進めることができます。HaloPlex により特異性・均一性の高いターゲットエンリッチメントが可能で、高い精度でバリアント検出を行うことができます。

HaloPlex イルミナシーケンシング対応キットの特長

  • 最大で 5 Mb のターゲット領域 (500 kb、2.5 Mb, 5 Mbの 3サイズに対応したキット構成)
  • スタート DNA はわずか 225 ng
  • 96 インデックス利用可能
  • HiSeq, MiSeq, GAIIx 対応

HaloPlex Ion PGM 対応キットの特長

  • 最大で 2.5 Mb のターゲット領域 (250 kb、2.5Mb の 2サイズに対応したキット構成)
  • Paired-end by Design によりターゲット領域の両側からのリードを取得
  • スタート DNA はわずか 225 ng
  • 16 インデックス利用可能
  • Ion PGM 対応

原理 - ワークフロー -

Workflowハイブリダイゼーション前に、ゲノム DNA の物理的断片化やアダプタ付きライブラリの調製を行う必要はありません。シンプルな 4段階のステップ (図 1) で実験は完了します。

I. サンプル DNA の切断
8組の制限酵素によりサンプル DNA を消化して断片化し、変性させます。

II. プローブのハイブリダイゼーション
HaloPlex プローブライブラリを加え、プローブをターゲット DNA 断片にハイブリダイズさせます。各プローブは、ターゲット断片の両端、制限酵素切断サイトからの 20数ベースにハイブリダイズするように設計されています。HaloPlex プローブとターゲット断片がハイブリダイズすることで、ターゲット断片と HaloPlex はニックのある環状構造を形成します。HaloPlex プローブにはシーケンスメソッドに固有のモチーフやバーコード配列も含まれます。

III. ターゲットの精製とライゲーション
HaloPlex プローブはビオチン化されており、ストレプトアビジン磁気ビーズによりハイブリダイズしたターゲット断片を精製することができます。環状 DNA のニックをライゲーション反応によって閉じます。この際、両側のプローブが正しくハイブリダイズした断片だけが、1本鎖環状 DNA となります。また、シーケンスメソッドに固有のモチーフやバーコード配列を含む配列も、環状化する際に取り込まれます。

IV. PCR によるターゲット断片の増幅
最後に PCR を行います。HaloPlex プローブから組み込まれた共通配列対するプライマーペアを用いて増幅を行います。増幅は共通配列から外側に向かって行われるため、ライゲーションでニックが閉じられた環状 DNA ターゲットだけが増幅されます。増幅産物にはシーケンシングに必要な配列がすべて含まれ、すぐにシーケンサにかけることができます。

原理 - ターゲット領域を複数アンプリコンでカバー -

Workflow

HaloPlex ではゲノム DNA を 8組の制限酵素で別々に断片化し、最終的にターゲットとする領域に対して複数のアンプリコンが生成されます。

PCR のみによるアンプリコンシーケンスではターゲットあたり 1つにアンプリコンのみで、変異なのか PCR エラーなのか判定が困難ですが、HaloPlex では複数アンプリコンで変異を検出できるため信頼性が向上します。HaloPlex では制限酵素サイトに変異が入ればそのフラグメントはエンリッチされませんが、他のフラグメントでカバーされるため結果を得ることが可能です。

 

 

原理 - Paired-end by Design (Ion PGM対応キット) -

Workflow

HaloPlex Ion PGM 対応キットでは、Paired-end by Design 方式により、シーケンシング自体は Single end で行いながら、ターゲット領域の両側からのリードが得られ、Paired-end に匹敵するカバレッジを達成します。

センス鎖、アンチセンス鎖それぞれについて HaloPlex プローブを作成し、両側ともキャプチャーします (Figure 3a)。 結果として、同じターゲット領域に対してシーケンシング方向が逆向きとなるアンプリコンが生成されます (Figure 3b)。その結果、Single end でシーケンシングするとターゲット領域の両側からリードが得られることになります。