pBK-CMV Phagemid Vector

pBK-CMV ファージミド ベクター

  • 原核生物と真核生物の両方の発現を可能に
  • ZAP Express ラムダ ベクターから切り出されたpBK-CMV
  • MCSは17の制限酵素部位を含む
 
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用途

  • cDNA合成キットと用いて定方向のセンスとアンチセンス インサート クローニング
  • 連続した exo/mung deletions の作製
  • f1 オリジンを用いた一本鎖DNAのレスキューが可能
  • 二重鎖または一重鎖でのシークエンシングに

選択法

  • バクテリアではカナマイシン耐性、真核生物細胞ではG418耐性
  • E. coli での青/白スクリーニングが可能

スクリーニング

  • ファンクショナルスクリーニング、もしくは核酸プローブによるスクリーニング

プロモーター/転写/発現

  • T7 および T3 RNAポリメラーゼにより in vitro でのRNA転写可能
  • 真核生物でのタンパク質発現用のCMVプロモーター###
  • 原核生物のタンパク質発現用の lac プロモーター

原核細胞での発現

原核細胞でのタンパク質発現は lac プロモーターから進められますが、LacI タンパク質の存在下では抑制され、IPTG により誘導可能です。β-ガラクトシダーゼ遺伝子のα-相補的部分の下流側にポリリンカーが配置されており、インサートを有するクローンを青/白スクリーニングにより選択可能です。インサートのないベクターを含むコロニーまたはプラークは、X-gal および IPTG の存在下では青色になります。これに対してインサートを有するベクターを含むコロニーまたはプラークは白色となります。インサートを有するコロニーはインサート遺伝子を融合タンパクとして発現できるので、抗体を用いて発現の有無をスクリーニングすることができます。カナマイシン耐性遺伝子は、バクテリアでは bla (β-ラクタマーゼ)プロモーターにより発現されます。

真核細胞での発現

真核細胞での発現は、CMV immediate early (最初期)プロモーターによっておこります。SV40ポリアデニル化フラグメントは、転写終了およびポリアデニル化に必要なシグナルをコードしています。イントロンがインサートの下流側に配置されており、5' スプライシング部位は Kpn I 部位とT7プロモーターの間に、また3' スプライシング部位は lacZ 配列の下流側となっています。ネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子の存在により、真核細胞でのクローンの安定な選択が可能となっています。耐性遺伝子はSV40 early プロモーターで発現されます。

ポリリンカーとssDNAレスキュー

ポリリンカーは17の制限酵素部位を含んでおり、連続した exo/mung deletions の作製が可能です。Spe I/Xba I や Sal I/Xho Iのようなコンパティブルな制限酵素部位は EcoR I 部位の逆側に位置しており、ZAP Express cDNA合成キットを用いることでセンスとアンチセンスの両インサートを定方向でクローニングすることが出来ます。 f1 オリジンはマイナスの方向にあります。アンチセンスのインサートを含むssDNAはM13ヘルパーファージを用いて作製することもできます。

>>  Footnotes

  • 1. Alting-Mees, M.A., et al.  (1992), Strategies. 5: 58-61.

 
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pBK-CMV Vector

212209 20 µg お問い合わせください Call
Allows both prokaryotic and eukaryotic expression: pBK-CMV phagemid vector, Host strain: XL1-Blue MRF', Helper phage: R408
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