AffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kit and QRT-PCR Master Mixes

  • 迅速かつ高効率でQRT-PCR用のcDNAを合成
  • 高温を含む幅広い温度帯での逆転写が可能
  • 簡潔なプロトコールなのでcDNA合成は15分で完了
  • マスターミックス仕様なのでコンタミやピペッティングによるエラーが最小限
  • 3pgから3μgの範囲で高い再現性
 
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幅広い温度帯で高い活性を維持し、QRT-PCRの感度が向上

AffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kitは、幅広い反応温度帯で高い活性を持つAffinityScript Multi Temperature Reverse Transcriptase を用いたcDNA合成キットで、2-stepでの逆転写定量PCR(QRT-PCR)に最適化されています。本酵素では、MMLV由来の逆転写酵素に複数の変異を導入することで、37~55℃の間で高い活性を長時間維持することができ、高温での逆転写反応でも十分な量の cDNA合成が可能になっています。

このように本製品では、幅広い温度帯で高い収量が得られるため、ランダム・ヘキサマーによる室温での逆転写反応だけでなく、特異的なプライマーを用いた逆転写反応や、GCリッチや二次構造等の難しい配列からの逆転写で、高温での反応が必要な場合にも有効です。

また本製品では、様々なRNAのテンプレート量でも再現性が高く、高感度で対応できるようにバッファーが最適化されています。さらにcDNA合成を阻害する核酸分解酵素の混入を徹底的に排除し、酵素の精製度を高めています。このため本製品では、二次構造等を持つ難しいテンプレートからでも、これまでにない高い再現性と感度を兼ね備えた、2-stepでの逆転写定量PCR(QRT-PCR)を行うことができます(図1)。

図1 AffinityScript QPCR cDNA synthesis kitによる高感度での2-Step QRT-PCR

AffinityScript QPCR cDNA synthesis kit (濃緑色) では、 2-Step QRT-PCRにおいて、他社のcDNA 合成キットよりも高い感度が得られました(B 社:黄緑色、Q社:オレンジ色、I社:ピンク色). cDNA合成は各製品の推奨プロトコールに従い、アジレント(旧ストラタジーン)のBrilliant SYBR® Green QPCR Master mixを用いて増幅を行いました。

マスター・ミックス仕様なので実験が簡素化

AffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kitでは、プロトコールが簡素化されているため全ての実験が25分で完了でき、従来の方法と比べて大幅な時間の削減が可能です。この他にも、合成時間が15分と短いにもかかわらず最大合成鎖長が12kbと長く、また、マスター・ミックス仕様なのでピペッティングのエラーによる反応間のCtのばらつきも最小限に抑えることができます(図2)。

図2 AffinityScript QPCR cDNA synthesis kitによる幅広い温度帯でのcDNA合成

異なるテンプレート量のTotal RNA(100ng、10ng、1ng) からOligo dTプライマーを用いて、3つの異なる反応温度 (42、50、55℃) でcDNA合成反応を行ったところ、どの反応温度でも同じCt値が得られました。

プライマーの選択

プライマーの選択は、cDNAの合成量、感度、GCリッチな塩基配列や転写産物の5’-や3’-末端近辺の塩基配列の検出等に大きな影響を及ぼします。AffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kitには、マスター・ミックスとは別に、ランダム・プライマーとoligo-dT プライマーの両方が含まれているため、目的や標的の遺伝子に応じてこれらのプライマーを使い分けることができます。

豊富な製品構成

2-stepでのQRT-PCRは、同一のcDNAから複数の標的遺伝子の解析を行いたい場合や、cDNAを他の実験に用いたい場合、QPCR試薬を使い分けたい場合などに有効です。 AffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kitは、Brilliant QPCR試薬のプローブ用(Brilliant II QRT-PCR, AffinityScript 2-Step Master Mix: #600827)、SYBR® Green用(Brilliant SYBR® Green QRT-PCR, AffinityScript Two-Step Master Mix: #600585)のいずれの試薬にも使えるよう、最適化されています。これらの製品は、RNAを精製することなく細胞から直接QRT-PCR を行えるSideStep II製品と組み合わせることができます。また、#600585はQRT-PCR抑制因子検出用のAlien QRT-PCR Inhibitor Alert(#300600)と組み合わせることもできます。

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AffinityScript One-Step RT-PCR Kit

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AffinityScript One-Step RT-PCR Kit has been engineered to deliver the highest yield of any one-step RT-PCR kit.
Contains: 2X RT-PCR master mix containing AffinityScript RT/RNase Block and all components necessary to carry out both reverse transcription and PCR amplification of cDNA, ヘラクレス(Herculase) II and Pfu dUTPase/ArchaeaMaxx, and RNase free water.
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AffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kit, 50rxn

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Our AffinityScript QPCR cDNA synthesis kit delivers fast, efficient cDNA synthesis for QRT-PCR
AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase/RNase Block Ribonuclease Inhibitor enzyme mix, 2X cDNA Synthesis Master Mix, oligo(dT) and random primers, Rnase-free water
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Brilliant II QRT-PCR, AffinityScript Two-Step Master Mix

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High performance, ultra sensitive, next generation QRT-PCR 2-step master mix reagent with AffinityScript RT for reliable quantification across a wide range of targets and templates.
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