StrataClone PCR Cloning Kits [RUO]

高い効率のDNA トポイソメラーゼ I　PCR クローニング

アジレント(旧ストラタジーン)の革新的なクローニングシステムは、２０年に渡り遺伝子のクローニング・解析を容易にしてきました。アジレント(旧ストラタジーン)の新しいStrataClone PCR クローニング キットにより従来のPCR クローニング法よりも、簡単、迅速、確実にPCR 産物のクローニングができます。通常のPCR クローニングではゲル精製、制限酵素消化、平滑末端化、脱リン酸化、オーバーナイト ライゲーション反応等、複数のステップが必要で、それぞれ異なる酵素により触媒されます。従来の方法は時間を要する上、困難を伴うこともあり、目的の遺伝子のクローンを得るまでに何回も繰り返す必要があることもあります。

本製品はトポイソメラーゼを利用したクローニング方法で、簡単な3－ステップのプロトコールでPCR産物のクローニングができます。特別なプライマーデザインやPCR産物のclean-upは必要ありません。PCR産物をベクターミックスに加え、室温で５分間インキュベートするだけでライゲーションが完了します。その後コンピテントセルに形質転換することで、９５％以上にものぼる効率でのクローニングが可能です。

DNA トポイソメラーゼ I　とCre リコンビナーゼ

アジレント(旧ストラタジーン)のStrataClone PCR クローニング システムはVaccinia ウイルス由来のDNA トポイソメラーゼ I およびバクテリオファージ P1由来のCre リコンビナーゼの二つの酵素を活用しています。Vaccinia においてDNA トポイソメラーゼ I はDNA鎖を切断・結合することによりDNAの複製を補佐します。この酵素の部位特異的エンドヌクレアーゼ活性が直鎖状DNAを作り出し、複製が終了するとDNAリガーゼ活性によりDNA鎖を閉じます。トポイソメラーゼ I が２本鎖DNAのホスホジエステルバックボーンを切断すると、DNA‐酵素の共有結合中間体が形成されます。この中間体に蓄えられた結合エネルギーは, 切断されたDNAを再結合し元のDNA鎖に戻すために利用されます。部位特異的なCre リコンビナーゼ酵素は２つのloxP認識配列の間のDNA組み換えを触媒します。

StrataClone PCRクローニング キットを蛍光タンパク質（664 bp）、γグロブリン（1.8 kb）、βグロブリン（3.5 kb）、ヒトα1アンチトリプシン（6 kbと 9.2 kb）から増幅したPCR断片をクローンするのに使用しました。1‐3のPCR断片をクローンするのために未希釈のPCR反応産物（2 μl）を使用しました。4と5の大きなPCR産物に関してはクローンニング前にゲル精製を行いました。PCR断片1はプラスミドDNA、PCR断片2は１ｓｔ Strand DNA、断片3、4、5はヒトゲノムDNAから増幅しました。PCR反応にはTaq2000 DNA Polymerase (664 bp と 1.8 kb)、Easy-A High-Fidelity PCR Cloning enzyme (3.5 kb)、TaqPlus Long PCR System (6 kb と 9.2 kb)を使用しました。コロニーをランダムに選択し、制限酵素消化により結果を確認しました。（PCR産物をゲルからの抽出にはアジレント(旧ストラタジーン)のStrataPrep Gel Extraction Kitが最適です。）

形質転換後の環状化

StrataClone PCR のベクターミックスには一方の末端にトポイソメラーゼ I が、もう一方の末端にloxP組み換え配列を含んだDNAアームが含まれています。トポイソメラーゼ I 認識カセット側の末端には、Taq により増幅されたPCR産物を直接ライゲーションできるように、ウリジン（U）‐突出末端があります。PCR産物をベクターミックスに加えると、トポイソメラーゼ I がPCR産物とベクターアームをライゲーションし、直鎖分子（ベクターアーム-PCR産物-ベクターアーム）を作りだします。ライゲーションされたDNAは洗浄作業無しにそのまま、Cre リコンビナーゼを発現するコンピテントセルに形質転換されます。直鎖DNAはloxP部位でCre リコンビナーゼにより環状にされ、組み換えベクターは一晩のインキュベートにより増幅されます。ポジティブ インサートのクローンは青/白スクリーニングにより簡単に検出可能です

StrataClone を使用し、ヒトα1アンチトリプシン由来の6 kbのアンプリコンをクローニングしました。アジレント(旧ストラタジーン)のTaqPlus Long PCR SystemによりヒトゲノムDNAからPCR産物を増幅し、クローニング前にゲル精製をおこないました。コロニーをランダムに選択し、ミニプレップDNAをBsp106I と SacIIにより消化しました。

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Figure 2 StrataClone Blunt PCR Cloning Vector Map

Figure 1 Overview of the StrataClone Blunt PCR Cloning Method.

ORDERING INFORMATION

Product	Catalog #	Amount	Price
StrataClone Ultra Blunt PCR Cloning Kit 240218 20 rxn お問い合わせください Call New improved vector now includes amp and kan resistance. High efficiency blunt-end PCR cloning, features DNA topoisomerase I and Cre recombinase technologies. Includes StrataClone Blunt vector mix, PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase, cloning buffer, and competent cells for 20 reactions. Includes controls. 分析保証書 (C of A)　　 マニュアル
StrataClone Blunt PCR Cloning Kit 240207 20 rxn お問い合わせください Call New improved vector now includes amp and kan resistance. High efficiency blunt-end PCR cloning, features DNA topoisomerase I and Cre recombinase technologies with Amp and Kan resistance. Vector mix, cloning buffer, and competent cells for 20 reactions. Includes controls. 分析保証書 (C of A)　　 マニュアル
StrataClone PCR Cloning Kit 240205 20 rxn お問い合わせください Call DNA トポイソメラーゼ I およびCre リコンビナーゼを用いた高効率でのPCRクローニングキット ベクター・ミックス、クローニング・バッファー、コンピテントセル、コントロール・インサート、pUC18コントロール・プラスミド 分析保証書 (C of A)　　 マニュアル