Affinity Protein Expression and Purification System

Affinity タンパク質発現と精製システム

  • T7 RNAポリメラーゼ‐ベースの pET ベクター‡‡に由来する pCALベクター
  • とても穏やかなタンパク質の結合と溶出の条件
  • プロテアーゼ切断部位によりタグ等の付属部位の切断が可能 
  • ベクター、コンピテントセル、およびレジンから成るシステム
 
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用途

  • 高レベルのタンパク質発現
  • ワン‐カラム精製

高レベルタンパク質発現に最高のシステムです

Affinity タンパク質発現・精製システムはおだやかな結合・溶出条件を簡単なプロトコルで実現できる、高レベルでのタンパク発現・精製方法です。このシステムには、カルモジュリン‐結合ペプチドタグ融合タンパク質を発現させるためのpCAL 発現ベクターと、カルモジュリンレジンから構成されており、個別での購入も可能です。Affinity CBP タンパク質検出キットを使用することで、CBP融合タンパク質を迅速に、高感度検出することも可能です。

簡単な精製

T7 RNAポリメラーゼによるタンパク質発現システムをベースとしたpCAL ベクターでは、目的のタンパク質はカルモジュリン結合ペプチド(CBP)タグに融合された形で発現されます。CBPでタグ化された融合タンパク質は、カルモジュリン・レジン中を1回通過させるだけで、ほぼ均一な状態に精製されます。CBPタグは、低濃度のカルシウム存在下でカルモジュリン・レジンに結合し、2 mM EGTA存在下の中性pH条件下で溶出されます。6xHIS 親和性タグを用いた場合のような厳しい溶出条件が不要です。ベクターの種類にもよりますが、トロンビンもしくはエンテロキナーゼ(EK)によるプロテアーゼ切断部位が発現タンパク質とタグの間にあるので、CBPタグを除去するさいに便利です。EKの場合、その認識部位のC-末端側で切断されるので、EKで処理することによって余分なアミノ酸を残すことなく、目的のタンパク質を精製することができます。

pCAL ベクター

  • 高いレベルでのタンパク質発現
  • 厳密な発現コントロールが可能
  • タグの付加位置はC- 末端あるいはN-末端

選択法

E. coli ではアンピシリン耐性

クローニング部位

pCAL-n ベクター: BamH I、Sma I、EcoR I、Xba I、Nco I、Sal I、Xho I、Sac I、Hind III

プロモーター

T7/lacO プロモーター 

最高レベルのタンパク発現

pCALベクターは、タンパク質の発現レベルが高いことで定評のある、T7 RNAポリメラーゼをベースとしたpET-11シリーズのベクターに由来しています。すべてのpCALベクターには、T7/LacOプロモーターとプラスミド由来のlacIq遺伝子があり、大腸菌での厳密な発現コントロールが可能です。大腸菌BL21(DE3)もしくはBL21(DE3)pLysSにおいては、IPTGの存在下でT7 RNAポリメラーゼの発現が誘導されます。そのT7ポリメラーゼは、pCALベクターのT7プロモーターに結合し、転写を開始します。このpCALベクターを用いることで、C-末端あるいはN-末端にCBP親和性タグを融合させた目的のタンパク質を高レベルで発現させることが可能です。

Images

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Affinity Purification The JNK gene was cloned into the pCAL-n vector and transformed into BL21(DE3) pLysS cells. Cultures were induced with IPTG and lysed. Lane 1: Input lysate, Lane 2: Flowthrough lysate, Lane 3: Eluate
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>>  Footnotes

  • 1. Stofko-Hahn, R.E., Carr, D.W., and Scott, J.D. (1992), FEBS Lett. 302: 274-278.
  • 2. Carr, D.W., et al. (1991), J. Biol. Chem. 266: 14188-14192.
  • 3. Means, A.R., et al. (1991), In Cellular Calcium, A Practical Approach (J.G. McCormack and P.H. Cobbold, eds.). IRL Press, Oxford. 
  • 4. Simcox, T.G., et al. (1995), Strategies. 8: 40-43.
  • 5. Studier, F.W., et al. (1990), Methods Enzymol. 185: 60-89.
  • 6. Weiner, M.P., et al. (1994), Strategies. 7: 41-43.
  • 7. Vaillancourt, P., et al. (1994), Strategies. 8: 44.
  • 8. Lowenstein, E.J. (1992), Cell. 70: 431-442

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>>  Licensing

T7 Promoter:
U.S. Patent No. 4,952,496. For academic or non-profit laboratories, an assurance letter accompanies the sale of the products. For commercial laboratories, a research use license agreement must be entered into prior to purchase of the products.

FLAG® Epitope-tag:
Manufactured under license from Sigma-Aldrich Co. under U.S. Patent Nos. 4,703,004, 4,782,137 and 4,851, 341. Other patents pending.

Anti-FLAG® antibody:
Purchased from Sigma for resale under license from Sigma-Aldrich Co. under U.S. Patent Nos. 4,703,004, 4,782,137 and 4,851,341. Other patents pending. FLAG® and Anti-FLAG® are registered trademarks of Sigma-Aldrich Co. M1, M2, and M5 are trademarks of Sigma-Aldrich Co. Use of this product is solely for investigational, experimental or research purposes. Not for commercial, diagnostic or therapeutic uses.

 
Product Catalog # Amount Price

pCAL-c Vector

214301 1 kit お問い合わせください Call
Derived from pET-11d, Recombinant proteins expressed as C-terminal fusion to the CBP affinity tag, Thrombin-cleavage site is immediately downstream of BamH I cloning site
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pCAL-n Vector

214302 1 kit お問い合わせください Call
Derived from pET-11a, Recombinant proteins expressed as N-terminal fusion to the CBP affinity tag
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pCAL-n-EK Vector

214310 20 µg お問い合わせください Call
Contains enterokinase cleavage site, Derived from pET-11a, Recombinant proteins expressed as N-terminal fusion to the CBP affinity tag
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pCAL-n-FLAG Vector

214311 20 µg お問い合わせください Call
Derived from pET-11a, Recombinant proteins expressed as N-terminal fusion to the CBP affinity tag which is followed by the Thrombin target, the FLAG epitope tag and the Enterokinase target
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Calmodulin Affinity Resin, 10 ml

214303 10 ml お問い合わせください Call
Calmodulin binding peptide (CBP) affinity resin
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