Mammalian Two-Hybrid Assay Kit

Mammalian Two-Hybrid Assayキット

  • 哺乳類細胞でのタンパク質‐タンパク質相互作用を検出
  • 幅広い種類の哺乳類細胞での解析が可能
  • 2種類のタンパク質あるいは酵母two-hybridスクリーニングによって同定されたタンパク質間相互作用を哺乳類細胞で確認
  • 欠損変異や部位特異的変異を導入しタンパク質‐タンパク質相互作用に必須なドメインやアミノ酸を同定
  • ベイト・ベクター、ターゲット・ベクター、pFR-Lucレポーター・ベクター、コントロール・プラスミドを含む
 
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哺乳類細胞を用いたTwo-Hybridシステム

アジレント(旧ストラタジーン)のMammalian Two-Hybrid Assay Kitは、哺乳類細胞を用いてタンパク質の相互作用を検出可能なシステムです。哺乳類細胞を使用しているため、哺乳類由来のタンパク質の立体構造や翻訳後修飾が本来のとおりに行われることが期待されます。タンパク質の立体構造や翻訳後修飾は、タンパク質間の相互作用に少なからず影響を与えると考えられるため、大腸菌系あるいは酵母細胞系でのTwo-Hybrid解析で得られた相互作用を、本システムによる哺乳類細胞でのTwo-Hibrid解析で最終確認することができます。

ベイトのタンパク質はGAL4 DNA結合ドメインと融合タンパク質として、ターゲットのタンパク質はNF-kB活性化ドメインとの融合タンパク質として哺乳類細胞中で発現されます。さらに、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子としてもつレポーター・コンストラクトも同時に哺乳類細胞に導入されているので、ベイトとターゲットが相互作用するとルシフェラーゼ遺伝子の転写が活性化されます。

高感度で高い汎用性

本システムには、高活性を実現するためのいくつかの特徴があります。まず、マウスNF-kB p65由来の転写活性化ドメインの中でもっともアクティブな部位を用いて、ターゲットとの融合タンパク質が作製されますので、一般的に用いられているVP16活性化ドメインよりも高い活性を得ることができます。またベイト、ターゲットともに、種々の哺乳類細胞株で働くことが知られているCMVプロモーターにより発現されます。さらに、本製品で使用されているルシフェラーゼ・レポーター遺伝子は、使いやすく高い検出感度を得ることができます。

相互作用に必須の部位の同定にも

いったんタンパク質間の相互作用が確認されれば、さらにベイトプラスミドやターゲットプラスミドへの欠失変異・点変異の導入と組み合わせることで、本システムを用いてタンパク質‐タンパク質間相互作用に必須のドメインやアミノ酸を同定することも可能です。

Images

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Detection of p53 and SV40 Large T-Antigen Interaction in Various Cell Lines Pairs of positive or negative control plasmids (10 ng for CHO, COS, HeLa, and HLR cell lines; 100 ng for 293 cells) were transfected into HLR cells (0.8 x 105 cells) or cotransfected with 0.25 mg of the reporter plasmid pFR-luc into CHO, COS, HeLa, and 293 cells (0.8 x 105 cells). Column 1: pBD-53 and pAD-TRAF plasmids; Column 2: pBD-CD40 and pAD-SV40 plasmids; Column 3: pBD-53 and pAD-SV40 plasmids. Cells were harvested and lysed for luciferase assay 48 hours after transfection.
Mammalian Two-Hybrid Scheme The GAL4 BD-X fusion protein binds to the GAL4 DNA binding site. Interaction between protein X (GAL4 BD-X fusion protein) and protein Y (NF-kB AD-Y fusion protein) brings the activation domain (AD) into close proximity to the DNA binding domain (BD) and results in activation of reporter gene expression through GAL4 binding sites.
Transcriptional Activity of GAL4 BD-NF-kB p65 vs. GAL4 BD-VP16 Fusion Proteins Panel A: Schematic depiction of GAL4 BD-NF-kB p65 and GAL4 BD-VP16 fusion proteins. Panel B: The indicated plasmids (10 ng) were transfected into HeLa-luc cells (0.8 x 105 cells) or cotransfected with 0.25 mg of the reporter plasmid pFR-luc (PathDetect reporter plasmid) into CHO and 293 cells (0.8 x 105 cells). Cells were harvested and lysed for luciferase assay 48 hours after transfection.

>>  Footnotes

  • 1. Phizicky, E.M. and Fields, S. (1995), Microbiological Review 59: 94-123.
  • 2. Dang, C.V., et al. (1991), Mol. Cell Biol. 11: 954-962.
  • 3. Hosfield, T. and Chang, C. (1999), Strategies 12: 49-51

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>>  Licensing

CMV promoter:
Use of the CMV promoter is covered under U.S. Patent Nos. 5,168,062 and 5,385,839 owned by the University of Iowa Research Foundation and licensed FOR RESEARCH USE ONLY.

A license (from Promega for research reagent products and from The Regents of the University of California for all other fields) is needed for any commercial sale of nucleic acid contained within or derived from this product.

 
Product Catalog # Amount Price

PathDetect pFR-Luc Plasmid

219050 50 µg お問い合わせください Call
Luciferase reporter plasmid. Indicates activation of upstream pathways.
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