PathDetect Cis-Reporting Systems

PathDetect Cis-レポーター・システム

シグナル伝達経路特異的な転写活性を特定
ウェスタン・ブロット法やゲルシフト法より簡単、迅速
高感度で、定量解析が可能
抗体も提供

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エンハンサー・エレメントは、多くの細胞内シグナル伝達経路の収束点となっています。PathDetect cis-レポーター・システムを使用すれば、シグナル伝達のin vivoでの活性化を迅速かつ簡単に評価できます。各cis-レポーター・プラスミドは、AP-1、CRE、SRE、ISRE、GAS、NFAT、NF-kB、p53、SRF、TAREなどのタンデム・リピート結合エレメントと結合しているプロモーター・エレメント (TATAボックス)によって制御されるルシフェラーゼ・レポーター遺伝子をもっています（表１、図２）。研究対象の遺伝子を発現するプラスミドをcis-レポーター・プラスミドと共に哺乳類細胞にトンスフェクションしたとき、ルシフェラーゼの発現が上がれば、直接または間接的に転写が活性化されたことを示唆します（図１、図３）。cis-レポーター・プラスミドは、未知の遺伝子、成長因子、薬物の候補物質、細胞外刺激因子等の評価に用いることができます。シーケンスや制限酵素サイトを公開していないものについては、hrGFP関連製品では購入後に製品に紙媒体にて付与したり、公開しているものがございます。一部、電子媒体での提供も可能です。お手数ですが、お問い合わせ頂けます様、お願い致します。

様々なエンハンサー・エレメントの研究

上記のエンハンサー（表１）以外のエレメントが必要の場合、pLuc-MCSプラスミドに研究対象のcis-acting DNAエレメントをインサートすることが可能です。このプラスミドはルシフェラーゼ遺伝子とTATAボックスの上流にマルチクローニング部位をもっており、どのようなエンハンサーの研究も可能にします。

VitalityhrGFP レポーターを用いてIn Vivo活性化を検出

海洋生物から新たに得られたヒト化緑色蛍光タンパク(humanized green fluorescent protein; hrGFP)をもつPathDetect cis-レポーター・プラスミドも提供しています。この新規のhrGFPレポーターは、オワン・クラゲ（Aequoria victoria）由来のEGFPなどの毒性が高い緑色蛍光タンパク質に比べ、毒性が低いため、多種の細胞株に使用することが可能です。hrGFP レポーター・プラスミドを機能未知の遺伝子を含む哺乳類発現ベクターと同時にトランスフェクションすれば、細胞を破壊することなく、蛍光顕微鏡、蛍光測定器(fluorometer)、またはfluorescence activated cell-sorting（FACS）などによって、経路特異的な転写活性を定量解析することが可能です。PathDetectシステムのhrGFPレポーター・タンパク質を利用すれば、薬物探索などさらに多くの用途に用いることが可能になります。

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Figure 2. Structure of PathDetect Cis-Reporting System Plasmids Using Vitality hrGFP or Luciferase Each cis-reporter plasmid contains tandem repeats of one of the indicated enhancer elements; the multiple cloning site of pLuc-MCS contains standard restriction sites for insertion of any enhancer. For each reporter plasmid, the enhancer element and TATA box control expression of the reporter gene (A: Vitality hrGFP or B: luciferase). The hrGFP gene is controlled by one of four different enhancer elements. The luciferase gene is controlled by one of 10 enhancer elements.

Figure 3. Detection of Transcription Activation by Luciferase Activity. 1 µg of pNF-kb-Luc plasmid was cotransfected into HeLa cells with increasing amounts of the pFC-MEKK plasmid, serving as the positive control. Luciferase activity was measured 48 hrs post-transfection. The results show virtually no luciferase activity in untransfected HeLa cells, background levels of transcription in cells carrying only the pNF-kb-Luc plasmid, and several-fold amplification of signal from HeLa cells expressing MEKK.

Figure 1. How the PathDetect Cis-Reporting Systems Work. Extracellular signals trigger the activation of a series of intracellular molecules such as protein kinases and phophatases. Many of these signal transduction pathways converge at transcription factors that bind to specific enhancer elements found in the promoters of various genes and modulate the transcription of these genes. The activation of a signal transduction pathway can, therefore, be monitored by the expression level of the luciferase reporter gene controlled by the promoter containing these enhancer elements.

Table 1. PathDetect Cis-Reporting Systems Available from Agilent.

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A license (from Promega for research reagent products and from The Regents of the University of California for all other fields) is needed for any commercial sale of nucleic acid contained within or derived from this product.

Product

Catalog #

Amount

Price

PathDetect DR4/TR Cis-Reporting Plasmid

240136

50 µg

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PathDetect pDR4-Luc Cis-Reporter Plasmid