PathDetect Trans-Reporting Systems

PathDetect Trans-レポーター・システム

  • 研究対象の転写因子のリン酸化を誘導する刺激を特定
  • ウェスタンブロット法やゲルシフト法より簡単、迅速
  • 高感度で定量解析が可能
  • 抗体も提供
 
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cis-反応性エレメントの活性化は、二つ以上の転写因子の活性化によりもたらされていることが多くあります。多くのシグナル伝達経路は、特異的に転写因子をリン酸化し活性化するプロテイン・キナーゼに収束することが知られています。従って、PathDetect trans-レポーター・システムで用いられている転写因子の活性化の検出により、シグナル伝達経路における対象のタンパク質または化合物の関与がより正確に評価するこが可能です。

高感度、簡単なタンパク質機能解析

PathDetect trans-レポーター・システムにより、研究対象のタンパク質または化合物が、c-Jun、Elk1、CREB、c-Fos、ATF2、CHOPの6種類の転写因子のうちのいずれかを直接または間接的に活性化するかどうかを判定することができます。PathDetect trans-レポーター・システムはいずれも、レポーター・プラスミド、trans-activatorプラスミド、ポジティブ、ネガティブ・プラスミドから構成されています。レポーター・プラスミド、trans-activatorプラスミド、対象の遺伝子を含んでいる発現ベクターを選択した細胞株に同時にトランスフェクションするだけです。ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子の発現が対象の遺伝子が直接、または間接的にtrans-activatorプラスミドの転写因子のリン酸化および活性化に関与していること、すなわちシグナル伝達経路に関与していることを示唆します。

レポーター・プラスミドの選択

PathDetect システムにおいてルシフェラーゼ以外のレポーター・タンパク質を使用できるレポーター・プラスミド・シリーズを提供しています。新しく海洋生物から得たヒト化緑色蛍光タンパク(Vitalty hrGFP)、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ(CAT)、β‐ガラクトシダーゼ (β-Gal)、および分泌型アルカリ・ホスファターゼ (SEAP)がレポーター・タンパク質として利用できます。

レポーター・タンパク質はそれぞれ長所があり、行う実験により最善のものを選択できます。hrGFP は、蛍光顕微鏡、fluorescent activated cell sorting (FACS)、蛍光測定器(fluorometer)によりin vivo での検出が容易にできます。ß-Gal活性は、分光光度計、96-穴プレートを利用する際に便利なマイクロプレート・リーダーによって解析できます。CAT レポーター・タンパクはin vivoでの半減期が約50時間です。このことは発現の蓄積量対変化量などの結果が必要な場合には長所となります。

SEAPレポーターは、細胞を溶解することなく継続的にモニタリングが可能です。これによって、サンプリングと測定の自動化が容易になります。上記の4種類のレポーターの中で、ルシフェラーゼが最も高感度なレポーターであることから、レポーター遺伝子の発現が極めて低レベルであると予想される場合には、ルシフェラーゼ・レポーターを推奨します。

全てのレポーター・プラスミドの基本骨格はオリジナルのpFR‐Lucと同じであり、PathDetect システムにおいて機能することが確認済みです。

シグナル経路特異的な活性化

シグナル経路特異的なtrans-activatorプラスミドは上流のシグナル伝達経路が活性化されるとリン酸化されるキメラtrans-activatorタンパク質を発現します。リン酸化は直接、あるいは別の中間シグナル経路を介しての間接的な場合もあります。各種のPathDetect trans-activatorプラスミドを使用することにより、様々なシグナル経路を研究することができます。もし希望のtrans-activatorプラスミドがない場合、pFA-CMVベクターを用いてご自分のベクターを作成することが可能です。このベクターには上流にGAL4 DNA 結合ドメインをもち、CMVプロモーター#により制御されるマルチクローニング部位があり、融合trans-activatorプラスミドの作製が容易にできます。

低いバックグラウンドと高い活性

GAL4 DNA 結合ドメインは酵母菌の転写活性因子であり、これに効率的に結合する哺乳類の転写因子はありませんので、対象の転写因子以外はレポーター遺伝子の発現を誘導しません。融合活性因子のこのような特徴により、PathDetect trans-レポーター・システムの測定バックグラウンドは極めて低く抑えられます。本システムでは、200倍という高い活性が認められています。

安定細胞株

HLR細胞株は、レポーター遺伝子活性をもつ融合trans-activator-double-stable 安定細胞株です。これらの安定細胞株は、一連の形質導入と選択で構築されました。まず、ハイグロマイシン発現カセットを持つpFR‐LucプラスミドをHeLa細胞に形質導入し、PathDetectCREB、ELk1、c-Jun、CHOP trans-activatorプラスミドおよびコントロール・プラスミドを同時に形質導入したときに、ルシフェラーゼ活性が最も高く、バックグラウンドが最も低い細胞を単離しました。このクローン安定細胞株をHeLaルシフェラーゼ・レポーター(HLR)細胞株と称しました。Double-stable安定細胞株を構築するために、HLR細胞株に融合trans-activatorであるpFA2-CREB、pFA2-Elk1、pFA2-cJun、pFA2-CHOPプラスミドを形質導入しました。抗生物質による選別後、PathDetectキットのポジティブ・コントロール・ベクターで最も高い活性をもつクローンを選別しました。

形質導入を省略

HLR-CREB、HLR-Elk1、HLR-cJun、HLR-CHOPの各安定細胞株を転写因子CREB、Elk1、c-Jun、CHOPに収束するシグナル伝達経路の研究に使用できます。これらのHeLa安定細胞株は、GAL4-CREB、GAL4-Elk1、GAL4-cJun、GAL4-CHOP融合タンパク質を恒常的に発現し、GAL4融合タンパク質に反応するプロモーターによって制御されるホタル・ルシフェラーゼ遺伝子をもっています。これらの融合タンパク質はリン酸化により活性化され、プロモーターに結合するとルシフェラーゼの発現を誘導します。ルシフェラーゼの活性は融合trans-activatorタンパク質の活性と対応するシグナル伝達経路の活性に反映されます。これらのHeLa安定細胞株を使用すればトランスフェクションすることなく、細胞外刺激のこれらの転写因子に収束するシグナル伝達経路への影響を研究をすることができます。

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Figure 1. How the PathDetect Trans-Reporting Systems Work.
Figure 2. Detection of Transcription Activation by Luciferase Activity. The pFR-Luc reporter plasmid (1 µg) was cotransfected with 10 ng trans-activator plasmid plus 50 ng of the indicated control vector using lipfection methods. After transfection, cells were lysed and assayed for luciferase expression. The pFC-dbd plasmid expresses only the GAL4 DNA binding domain and is used as a negative control.
Figure 3. Structure of pathway-specific trans-activator plasmids. The trans-reporter plasmids were constructed by cloning the reporter gene sequence downstream of a basic promoter element (TATA box) and joined to five tandem repeats of the 17-bp GAL4 binding element.
Table 1. PathDetect Trans-Reporting Systems Available from Agilent.

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>>  Licensing

CMV promoter:
Use of the CMV promoter is covered under U.S. Patent Nos. 5,168,062 and 5,385,839 owned by the University of Iowa Research Foundation and licensed FOR RESEARCH USE ONLY.

A license (from Promega for research reagent products and from The Regents of the University of California for all other fields) is needed for any commercial sale of nucleic acid contained within or derived from this product.

Cell lines:

The HLR, HLR-cJun, HLR-Elk1 and HLR-CREB cell lines are proprietary to Agilent. Purchase of these cell lines includes a limited non-exclusive license under Agilent's proprietary rights to use these cell lines for research purposes only. This license does not grant any rights to: (i) modify any of these cell lines; (ii) offer any of these cell lines or any derivative or modification thereof, for resale; or (iii) otherwise distribute or transfer any of these cell lines, or any derivative or modification thereof, to third parties for any purpose or use. No other license, express, implied or by estoppel, is granted.

A license (from Promega for research reagent products and from The Regents of the University of California for all other fields) is needed for any commercial sale of nucleic acid contained within or derived from this product.

 
Product Catalog # Amount Price

PathDetect pFA-CMV Plasmid

219036 50 rxns お問い合わせください Call
Fusion trans-activator cloning vector. Create your own trans reporting vector with the pathway specific activator of your choice.
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PathDetect c-JUN trans-Reporting System

219000 50 rxns お問い合わせください Call
c-Jun N-terminal Kinase System Includes: pFR-Luc, pFA2-cJun, pFC2-dbd and pFC-MEKK plasmids
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PathDetect pFA-Jun Plasmid

219053 10 µg お問い合わせください Call
Activator plasmid for c-Jun reporting system
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PathDetect pFC-MEKK Plasmid

219059 10 µg お問い合わせください Call
Positive control plasmid. In the cis-reporting system use with pNF-kB-Luc, pNF-kB-hrGFP, pAP1-Luc, pAP1-hrGFP, and pSRE-Luc plasmids.
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PathDetect pMUT-cJun Plasmid

219041 10 µg お問い合わせください Call
Negative control plasmid for c-Jun reporting system
pMUT-cJUN plasmid

PathDetect CHOP Trans-Reporting System

219015 50 rxns お問い合わせください Call
p38 Kinase Pathway System Includes: pFR-Luc, pFA2-CHOP, pFC2-dbd and pFC-MEK3 plasmids
分析保証書(C of A) 分析保証書 (C of A)   マニュアル マニュアル

PathDetect pFA-CHOP Plasmid

219054 10 µg お問い合わせください Call
Fusion transactivator plasmid for CHOP reporting system
分析保証書(C of A) 分析保証書 (C of A)   マニュアル マニュアル

PathDetect CREB Trans-Reporting System

219010 50 rxns お問い合わせください Call
PKA (cAMP-dependent kinase) Pathway System Includes: pFR-Luc, pFA2-CREB, pFC2-dbd and pFC-PKA plasmids
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PathDetect pFA-CREB Plasmid

219068 10 µg お問い合わせください Call
Activator plasmid for CREB reporting system
分析保証書(C of A) 分析保証書 (C of A)   マニュアル マニュアル

PathDetect pFC-PKA Plasmid

219071 10 µg お問い合わせください Call
Positive control plasmid. In the trans-reporting system, use with the CREB reporting system. In the cis-reporting system, use with pCRE-hrGFP, pCRE-Luc, and pSRF-Luc plasmids.
分析保証書(C of A) 分析保証書 (C of A)   マニュアル マニュアル

PathDetect pMUT-CREB Plasmid

219042 10 µg お問い合わせください Call
Negative control plasmid for the CREB reporting system
pMUT-CREB plasmid

PathDetect Elk1 Trans-Reporting System

219005 50 rxns お問い合わせください Call
MAPK (mitogen-activated protein kinase) Pathway System Includes: pFR-Luc, pFA2-Elk1, pFC2-dbd and pFC-MEK1 plasmids
分析保証書(C of A) 分析保証書 (C of A)   マニュアル マニュアル

PathDetect pFA-Elk1 Plasmid

219062 10 µg お問い合わせください Call
Activator plasmid for Elk1 reporting system
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PathDetect pFC-MEK1 Plasmid

219065 10 µg お問い合わせください Call
Positive control plasmid for Elk1 reporting system
分析保証書(C of A) 分析保証書 (C of A)   マニュアル マニュアル

PathDetect pMUT-ELK1 Plasmid

219040 10 µg お問い合わせください Call
Negative control plasmid for ELK1 reporting system
pMUT-ELK1 plasmid

PathDetect pFR-CAT Trans-Reporter Plasmid

219001 50 µg お問い合わせください Call
Chloroamphenicol acetyltransferase reporter plasmid. Indicates activation of upstream pathways.
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PathDetect pFR-Luc Plasmid

219050 50 µg お問い合わせください Call
Luciferase reporter plasmid. Indicates activation of upstream pathways.
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PathDetect pFR-SEAPTrans-Reporter Plasmid

219004 50 µg お問い合わせください Call
Secreted alkaline phosphatase reporter plasmid. Indicates activation of upstream pathways.
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PathDetect pFR-B-Gal Trans-Reporter Plasmid

219002 50 µg お問い合わせください Call
b-galactosidase reporter plasmid. Indicates activation of upstream pathways.
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PathDetect pFA-ATF2 Plasmid

219026 50 rxns お問い合わせください Call
Fusion trans-activator plasmid
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PathDetect pFA-cFos Plasmid

219031 50 rxns お問い合わせください Call
Fusion trans-activator plasmid
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PathDetect pFC-MEK3 Plasmid

219086 10 µg お問い合わせください Call
Positive control plasmid
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PathDetect pFC-dbd Plasmid

219056 10 µg お問い合わせください Call
Negative control plasmid for all PathDetect trans-systems
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