Complete Control Inducible Mammalian Expression System

Complete Control 誘導性哺乳類発現システム

  • 哺乳類での濃度依存的な発現誘導
  • 1700倍にものぼる高い誘導
  • 厳格な抑制
  • IRESが同じCMVプロモーターからの両レセプター サブユニットの発現を可能に
  • レトロウイルスとプラスミド遺伝子デリバリー システムをご用意
  • レセプター安定細胞株もご用意
 
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用途

  • 哺乳類細胞における異種遺伝子産物の発現をコントロール
  • 形質導入の難しい細胞への遺伝子デリバリー用にレトロウイルス・システム

プロモーター:

  • pERV3 プラスミドとpFB-ERV レトロウイルス・ベクター にCMVプロモーター
  • pEGSH プラスミドとと pCFB-EGSH レトロウイルス・ベクターにSP1/minimal プロモーター

選択法

pERV プラスミド:哺乳類細胞でG418、E. coli ではカナマイシン pEGSH プラスミド:哺乳類細胞でハイグロマイシン、E. coli ではアンピシリン pFB-ERV レトロウイルス・ベクター:哺乳類細胞でG418、E. coli ではカナマイシンまたはアンピシリン pCFB-EGSH レトロウイルス・ベクター:哺乳類細胞でハイグロマイシン、E. coli ではアンピシリン

厳格なコントロール

Complete Control 誘導性哺乳類発現システムは哺乳類細胞における最も厳格な発現のコントロールを提供するためにデザインされました。このシステムは合成エクジソン誘導レセプターと研究対象の遺伝子の発現を調整する合成レセプター認識エレメントで構成されています。人工的なレセプターと認識エレメントにより内因性のホスト転写因子と遺伝子の活性化を誘発することがなく、非常に低いバックグラウンドを実現します。その上、レセプターは誘導物質の非存在下でも認識エレメントへ結合するので、さらにバックグラウンドの発現を抑えます。誘導物質(ponasterone A)の添加後は、レセプター サブユニットの構造的な変化が転写リプレッサーを取り除き、転写を始めるための機能を回復します。

パワフルな誘導

誘導は迅速で力強いものです。たった20時間の内にトランジエントでは1747倍にのぼる誘導、double-stable 細胞株では1030倍もの誘導が認められました。ponasterone A は直線的な用量反応曲線(linear dose response curve)をもたらし、誘導を簡単に調節することが可能です。

革新的なベクター

Complete Control システムでは発現をコントロールするために2つのベクターが使われています。合成レセプターはエクジソン・レセプター(EcR)とレチノイド‐X‐レセプター(RXR)から成るヘテロダイマーとして構成的に発現されます。レセプターの両サブユニットはpERV3 ベクターから生産され、internal ribosomal re-entry site (IRES)により、同じCMVプロモータから発現されます。この独特なデザインが多様な細胞株でのヘテロダイマー レセプターの発現を実現します。発現ベクター(pEGSH)は、T3 アンチセンス プローブを用いた RNase protection assay もしくは FLAG® エピトープを用いたウェスタン解析により、タンパク質発現の検出を容易にするようにデザインされました。

アジレント(旧ストラタジーン)はその用途を広げるために、レトロウイルス版のComplete Control 誘導性哺乳類発現システムを開発しました。レトロウイルスを利用した遺伝子デリバリーは、しばしば100%近い形質導入率をもたらし、また、プロウイルスのコピー数は感染のmultiplicity of infection (MOI) を変えることによって簡単にコントロールすることができます。後者の特徴は低いバックグラウンドと高誘導の比率がコピー数によって影響されるため、発現誘導システムにとって特に重要です。よって、最適なMOIでのウイルスによる標的細胞への形質導入は、大変なコロニースクリーニング無しに、望んでいる発現プロフィールのクローンを高い頻度で得ることができるはずです。二種のレトロウイルス・ベクターは pFB-ERV と pCFB-EGSHです。pFB-ERV ベクターは MMLV由来の複製能をもたないレトロウイルス・ベクターで、エクジソン・レセプタータンパク質であるRXR と VgEcR を導入します。一方、pCFB-EGSH レトロウイルス・ベクターは誘導可能なカセットを待っています。これらを一緒に使うことで、培養組織細胞において1000倍以上もの発現誘導率を達成します。

安定細胞株(Stable Cell Line)で時間を節約できます

double-stable 細胞株を作るための最良の方法は次のような手順です。まず初めに、pERV3 安定細胞株を確立し、pEGSH-luc コントロールベクターを用いてのトランジエント・アッセイで最も高い発現誘導と低いバックグラウンドを持つ株を選択します。それから、選択した株を使って、研究対象の遺伝子を含む pEGSH 発現ベクターによって double-stable 細胞株を作ります。アジレント(旧ストラタジーン)のCHO、NIH3T3そして293細胞株に由来するpERV3 stable 細胞株を使う事によって、この初めのステップを省略することが可能です。それぞれの細胞株の生存能力と機能は pEGSH-luc コントロールベクターを使ってのトランジエント・アッセイで、ponasterone A 誘導後にルシフェラーゼ発現を調べることにより検証されています。

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The Ecdysone-Inducible Expression System The Nuclear receptor proteins RXR and VgEcR are coexpressed from the CMV promoter VgEcR: hybrid nuclear receptor comprised of the ecdysone receptor (EcR) ligand-binding and dimerization domains, the VP16 transcriptional activation domain and the glucocorticoid receptor (GR) DNA binding domain. The heterodimeric ecdysone receptor remains bound to five copies of the E/GRE recognition element located upstream of a minimal promoter in the inducible expression cassete. The inductible promoter remains transcriptionally silent until induction with the ecdysone analogs muristerone A or ponasterone A. Interaction between the inducer and the EcR ligand-binding domain results in the recruitment of coacivator(s) and, thus, transcriptional activation that can reach over three orders of magnitude.

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>>  Licensing

CMV promoter:
Use of the CMV promoter is covered under U.S. Patent Nos. 5,168,062 and 5,385,839 owned by the University of Iowa Research Foundation and licensed FOR RESEARCH USE ONLY.

IRES element:
Use of these vectors is covered by U.S. Patent No. 4,937,190 and is limited to use solely for research purposes. Any other use of the pERV3 vector requires a license from WARF.

Use of this system by commercial entities for any commercial purpose requires the user to obtain a commercial license.

Expression control:
This product is the subject of one or more of U.S. Patent Nos. 5,514,578 and 6,245,531, and European Patent 0517805 licensed to Agilent.  The purchase of this product conveys to the buyer the non-transferable right to use the purchased amount of the product and components of the product in research conducted by the buyer outside of plants (whether the buyer is an academic or for-profit entity).  The buyer cannot sell or otherwise transfer (a) this product (b) its components or (c) materials made using this product or its components to a third party or otherwise use this product or its components or materials made using this product or its components for commercial purposes.  The buyer may transfer information or materials made through the use of this product to a scientific collaborator, provided that such transfer is not for the commercial purposes of the buyer, and that such collaborator agrees in writing (a) not to transfer such materials to any third party, and (b) to use such transferred materials and/or information solely for research and not for commercial purposes.  Commercial purposes means any activity by a party for consideration and may include, but is not limited to:

(1) use of the product or its components in manufacturing;
(2) use of the product or its components to provide a service, information, or data;
(3) use of the product or its components for therapeutic, diagnostic or prophylactic purposes; or
(4) resale of the product or its components, whether or not such product or its components are resold for use in research.

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Product Catalog # Amount Price

pERV3 Vector

217460 20 µg お問い合わせください Call
Receptor expression vector, CMV promoter easily replaced to confer cell-type specificity to receptor expression
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pEGSH Vector

217461 20 µg お問い合わせください Call
Ecdysone-inducible vector, MCS contains restriction sites positioned for directional cloning of inserts derived from Lambda ZAP -derived cDNA vectors, Lambda gt10, Lambda gt11, HybridZAP vectors and other two-hybrid libraries, Monitor gene expression using Alpha-FLAG immunoprecipitation or T3 antisense RNA probes
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Complete Control Vector Kit

217468 1 kit お問い合わせください Call
pERV3 vector, pEGSH vector, 1 mg ponasterone A, Sequencing primers
分析保証書(C of A) 分析保証書 (C of A)   マニュアル マニュアル

pFB-ERV Vector

217564 20 µg お問い合わせください Call
Receptor expression vector, CMV promoter easily replaced to confer cell-type specificity to receptor expression
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pCFB-EGSH Retroviral Vector

240028 10 µg お問い合わせください Call
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Ponasterone A, 1 mg

217467 1 mg お問い合わせください Call
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