LacSwitch II Inducible Mammalian Expression System

LacSwitch II 哺乳類発現制御システム

  • 真核細胞における遺伝子発現コントロール可能なベクター発現システム†††
  • 対象である挿入遺伝子のさらに厳密な抑制のためのCMV プロモーター### を持つ pCMVLacI
  • 対象の遺伝子を定方向に挿入するための8ヵ所のインサーション・サイトを持つ pOPRSVI/MCS
  • IPTG 誘導は真核細胞に対する悪影響無し
  • 4~8 時間以内の迅速な誘導
 
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用途

  • lac オペロンを利用して真核細胞における遺伝子発現をコントロールします
  • 遺伝子スイッチをオン/オフに切り替えることにより、遺伝子機能の研究に役立ちます
  • 細胞毒性遺伝子の研究に理想的です

クローニング・サイト

pOPRSVI/MCS: 次の8ヵ所の特異なサイトが含まれています - Kpn I、Xho I、Cla I、EcoR V、Sma I、Spe I、Xba I および Not I

pOPI3CAT: RSVプロモーターの除去用の特異サイト、標的遺伝子の挿入用の特異な Not I サイト

プロモーター:

pCMVLacI: CMV; pOPRSVI/MCS aおよびpOPI3CAT: RSV-LTR

選択法

pCMVLacI: 真核細胞においてハイグロマイシン耐性、E. coli ではアンピシリン耐性

pOPRSVI/MCS および pOPI3CAT: 真核細胞ではネオマイシン耐性、E. coli ではアンピシリン耐性

改良システム

LacSwitch II 誘導可能哺乳類発現システムは、pOPI3CAT、pCMVLacI および pOPRSVI/MCS ベクターから構成されています。pCMVLacI ベクターにより産生される Lac リプレッサー・タンパク質が、pOPI3CAT および pOPRSVI/MCS ベクターの特異的DNA配列(オペレーター)に結合すると転写が妨害されます。IPTGは、真核細胞に対する悪影響もなく、このオペレーター配列に対する Lac リプレッサータンパク質の結合親和性を低下させて、挿入遺伝子の転写および発現を開始させます。LacSwitch II システムならば、標的遺伝子の誘導を4~8時間以内に実現します。

厳密なリプレッション

pCMVLacI ベクターは、CMVプロモーターの強度により対象遺伝子を強力に抑制します。lac I 遺伝子が高度に発現されると、標的遺伝子が厳密に抑制されます。核局在配列 (NLS) は、Lac リプレッサーの発現を核側に向けます。

対象遺伝子の定方向挿入

定方向クローニングを促進するために、pBluescript II SK のマルチクローニング部位を pOPRSVI に装備しました。これによって得られた pOPRSVI/MCS ベクターにより、標的遺伝子の定方向挿入が可能となり、スクリーニングに必要な時間が短縮されます。pOPRSVI/MCS ベクターのMCSのいずれかの末端に T3 および T7 プロモーターが存在することにより、T3 および T7 プライマーによるポジティブ・インサートのシークエンシングと確認とが容易になります。

RSV プロモーターの除去

研究対象のプロモーターをRSV-LTR プロモーターの代わりに用いるために、LacSwitch II システムには pOPI3CAT オペレーター ベクターが含まれています。このベクターにはRSVプロモーターを除去できるよう、イントロンに3個のオペレーターと特異な制限酵素サイトが含まれています。

>>  Footnotes

  • 1. DuCoeur, L.C., Wyborski, D.L., and Short, J.M. (1992), Strategies. 5:70-72.
  • 2. Wyborski, D.L., and Short, J.M. (1991), Nucleic Acids Res. 191: 4647-4653.
  • 3. Fieck, A., Wyborski, D.L., and Short, J.M. (1992), Nucleic Acids Res. 20: 1785.
  • 4. Wyborski, D.L., DuCoeur, L.C., and Short, J.M. (1996), Environ. Mol. Mut. 28: 447-458

 
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LacSwitch II Mammalian Expression System

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100 µg pCMVLacl vector (1 mg/ml), 10 µg pOPRSVI/MCS vector (1 mg/ml), 10 µg pOPI3CAT vector (1 mg/ml), 1 g IPTG, Host strain: XL1-Blue MR
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