pDual Expression System

pDual 発現システム

  • 大腸菌および哺乳類細胞でタンパク質の高レベル発現
  • サブクローニングが不要
  • タンパク質をそのまま発現させることも、タグ融合タンパク質(c-Myc, 6XHis)として発現させることも可能
  • 大腸菌ではT7プロモーター制御下でのタンパク質発現
  • Seamlessクローニングも使用可能

 

 
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クローニング技術

  • Seamless クローニング技術と適合する Eam1104 I 制限部位
  • 定方向クローニングのためにパリンドロームでない付着末端を産出

プロモーター

  • 哺乳類細胞での高レベル発現のためのCMV プロモーター
  • 大腸菌での発現を厳密にコントロールするT7/lacO プロモーター

セレクション

  • 哺乳類細胞ではG418でのセレクション
  • 大腸菌ではカナマイシンでのセレクション

C‐末端へのタグ付加も可能

  • pDual GC ベクターでは 6xHis タグと c-myc エピトープタグを目的タンパク質のC末端に付加
  • pDual ベクターでは、検出とアフィニティー精製に利用可能なCBPタグをC末端に付加

CMV/T7プロモーターの制御によるDaul発現ベクター

pDual Expression Vectorは真核細胞と原核細胞の両方で、高レベルでのタンパク質発現が行えるベクターです。哺乳類細胞での発現には、ヒト・サイトメガロ・ウイルス(CMV)の最初期遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー領域が備えられており、恒常的な発現が可能です。細菌での発現では、T7/lacOハイブリッド・プロモーターにより制御されており、BL21(DE3)やBL21pLysSのようなT7 RNA polymerase遺伝子を持つ大腸菌でタンパク質発現が可能です。T7プロモーター制御下でのタンパク質発現のリークは、IPTGが十分量添加されるまでLacIqリプレッサーにより抑制されています。

大腸菌と哺乳類細胞における両発現系における選択マーカーは、β-lactamaseもしくはSV40プロモーターに制御されるネオマイシン・ホスフォトランスフェラーゼで、カナマイシン・ネオマイシンによる選別が可能です。本製品の特徴は、タンデムに配置された細菌由来のShine-Dalganoと哺乳類由来のKozak相同配列です。それぞれの配列は標的遺伝子のコドン開始点から最適な位置にあり、哺乳類細胞および大腸菌での転写活性が最大限い誘導されます。またpDualベクターはCBPタグを持っており、アフィニティー精製やウエスタン・ブロッティングでの検出に便利です。

検出・精製に便利なc-mycエピトープ・タグと6XHISタグ

pDual GC Vectorには、C-末端タグとしてヒトc-Mycエピトープ・タグ(EQKLISEEDL)が3コピー、6XHis精製タグが1コピー含まれています。これらのタグは目的タンパク質のC-末端に融合して発現され、哺乳類細胞あるいは大腸菌細胞の溶解液中での検出、精製に利用可能です。これらのタグによりどのような目的タンパク質でも検出・精製に同一のプロトコールを適用可能で、時間・コストを大幅に削減することができます。

Images

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Western Blot Analysis of Transfected Mammalian Lysates From CHO cell lysates, 1 mg of protein was electrophoresed on a 4-20% tris-glycine-SDS gel, then transferred to a nitrocellulose membrane, and reacted with antiluciferase (A) or anti-c-myc (B) antibodies. Antibody binding was detected using chemiluminescence methods. The difference in molecular weights of the different detected proteins is due to the use of epitope and purification tags. Estimated molecular weights: pDual GC + Luciferase is 68 kDa, pCMV-Tag5### + Luciferase is 63 kDa, and luciferase protein is 61 kDa. The difference in chemiluminescent signal between pDual GC + Luciferase and pCMV-Tag5 + Luciferase (B) is probably due to the presence of three copies of the c-myc epitope in the pDUAL GC vector and only one copy of the c-myc epitope in the pCMV-Tag5 vector. The lower molecular weight band that is detected at about 40 kDa with the anti-c-myc antibody (B) was also detected in control cells that had not been transfected with an expression vector (data not shown) and is believed to be a cellular protein that reacts with the c-myc-antibody.

>>  Footnotes

  • 1. Shine, J. and Dalgarno, L. (1974), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 1342-1346.
  • 2. Kozak, M. (1986), Cell. 44: 283-292.
  • 3. Padgett, K.A. and Sorge, J.A. (1998), Strategies. 10: 97-99.

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>>  Licensing

U.S. Patent Nos. 6,627,436

CMV promoter:
Use of the CMV promoter is covered under the U.S. Patent Nos. 5,168,062 and 5,385,839 owned by the University of Iowa Research Foundation and licensed FOR RESEARCH USE ONLY.

T7 Promoter:
U.S. Patent No. 4,952,496. For academic and non-profit laboratories, an assurance letter accompanies the sale of the products. For commercial laboratories, a research use license agreement must be entered into prior to purchase of the products.

 
Product Catalog # Amount Price

pDual Expression Vector

214501 20 µg お問い合わせください Call
Uncut vector with CBP tag: pDual vector (undigested), XL1-Blue host strain
分析保証書(C of A) 分析保証書 (C of A)   マニュアル マニュアル

pDual Expression Vector

214502 100 µg お問い合わせください Call
Uncut vector with CBP tag: pDual vector (undigested), XL1-Blue host strain
マニュアル マニュアル

pDual GC Vector

214503 20 µg お問い合わせください Call
Uncut vector with c-myc epitope and HIS6 purification tag : 1 µg/µl in TE buffer
分析保証書(C of A) 分析保証書 (C of A)   マニュアル マニュアル