タンパク質とペプチドのメソッド開発


タンパク質とペプチドの逆相メソッド開発のためのZORBAX選択方法

その他のメソッド開発方法
逆相LC/MSメソッドを用いたタンパク質およびペプチドの分離
タンパク質とペプチドのメソッド開発
このZORBAXカラム選択方法は、タンパク質とペプチドのメソッド開発に関するヒントを提供するためのものです。分子量2000未満のペプチド分子については、こちらをクリックしてメソッド開発方法をご覧ください。それ以上の大きさのペプチドやタンパク質のメソッド開発については、以下で提案するガイドラインを参照してください。高分子を効率的に逆相分離するためには、ワイドポアサイズ(300Å)のカラムが必要です。
各種タンパク質およびペプチドに適したカラムと分析条件を選択
ペプチド、ポリペプチド、タンパク質
(MW < 50 kDA)
ペプチド、ポリペプチド、タンパク質
(MW < 1,000 kDA)
StableBond 300SB-C8   メソッド開発初期段階での結合相の選択肢   Poroshell 300SB-C18

300SB カラムは、TFA を含む移動相でも寿命がきわめて長いワイドポアカラムです。こうした特徴により、ペプチドやタンパク質の分離に理想的なカラムとなっています。

  • 中度の疎水性を持つ C8 は、初期結合相として最適です。
  • C18 と C8 は通常、ペプチドやタンパク質消化物に用いられますが、タンパク質にも使用できます。
  • C3、C4、CN は通常、大型で疎水性のポリペプチドやタンパク質に用いられますが、ペプチドにも使用できます。

Poroshell 300SB カラムには、タンパク質の高速分離を可能にする革新的な粒子技術が採用されています。Poroshell カラムを使えば、短い分析時間で、高いピーク効率を簡単に得ることができます。また、300SB 結合相の使用により、TFA を含む移動相でも寿命がきわめて長くなっています。

  • C18 は、初期結合相として最適で、ほとんどのペプチド、ポリペプチド、タンパク質で最大限の保持力を発揮します。
  • C8 は通常、中型のタンパク質に用いられますが、すべてのサンプルに使用できます。
  • C3 は通常、抗体や大型のタンパク質の分析に用いられますが、すべてのサンプルに使用できます。
初期分離条件

カラム : 300SB-C8
4.6 x 150 mm、3.5 または 5µm
部品番号 : 883995-906
部品番号 : 863973-906

移動相 :
A : 95% H2O : 5% ACN、0.1% TFA含有
B : 5% H2O : 95% ACN、0.085% TFA含有

グラジエント : 60分で0 – 60% B
温度 : 35 - 40ºC
流速 : 1 mL/min

カラム : Poroshell 300SB-C18
2.1 x 75mm、5µm
部品番号 : 660750-902

移動相 :
A : 95% H2O : 5% ACN、0.1% TFA含有
B : 5% H2O:95% ACN、0.085% TFA含有

グラジエント : 10分で0 – 60% B
温度 : 35 - 40ºC
流速 : 2 mL/min

シンプルな水/有機溶媒グラジエント条件を用いて、低pHでスタートする

一般に、すべての目的化合物の溶出には、0.1% TFA を含む水/アセトニトリルのグラジエントが用いられます。300Å ポアサイズカラムにおける一般的な高分離能グラジエントは、30分から 60分を要します。Poroshell カラムでは、分析時間が短く、流速が速くなりますが、優れた分離能は維持されます。その後、分離能を向上するためには、グラジエント時間を延ばす、カラム長を短くする、流速を上げるなどの変更を行なってください。

サンプルの溶解度を最適化する

すべての pH で最良のピーク形状や回収率を得るためには、サンプルを完全に溶解できるようにすることが重要です。ZORBAX 300StableBond と Poroshell 300SB では、強酸性溶媒と中性溶媒を使用できます。ZORBAX 300Extend-C18 では、中性溶媒と希塩基性溶媒を使用できます。

タンパク質とペプチドを可溶化するための溶媒の選択肢
水/リン酸バッファ
希酸 (TFA、酢酸、HCl)
中性pH、6-8Mグアニジン-HCl またはイソチオシアネート
5% HOAc/6M尿素
希酸 + 水/有機溶媒 (ACN、MeOH、THF、IPA)
希塩基 (水酸化アンモニウム)
DMSOまたは0.1%-1% TFA を含む DMSO
ホルムアミド

温度を上げる

タンパク質やペプチドの分離は温度の影響を受けます。カラム温度を高くすれば、タンパク質や疎水ペプチド、凝集ペプチドの分離能と回収率が劇的に向上します。

StableBond 300SB – 温度上限 80ºC
Poroshell 300SB – 温度上限 80ºC

移動相のpHを最適化する
低pHで分離が出来ない場合は、中pHや高pHを試してみる

最適化した低 pH メソッドで思うように分離ができない場合は、中 pH または高 pH の移動相を使用してください。高 pH では多くの場合、酸性アミノ酸が負の電荷を帯び、一部の塩基性アミノ酸が電荷を失うため、選択性が大きく変化します。中 pH から高 pH での分離には、ZORBAX 300Extend-C18 が最適です。

カラム : 300Extend-C18、4.6 x 150 mm、5 mm
部品番号 : 773995-902

移動相 :
A : 20 mM NH4OH を含む H2O
B : 20 mM NH4OH を含む 80% ACN

流速: 1 mL/min
温度: 25 - 30ºC (60ºCを越えないこと)
グラジエント: 30分で5 – 60% B

ペプチドとタンパク質の分離に適したカラムの選択方法
低 pH
中および高 pH
MW < 50 kDa
300SB-C8

4.6 x 150 mm、3.5µm
部品番号 : 863973-906
MW < 1000 kDa
Poroshell 300SB-C18

2.1 x 75 mm、5µm
部品番号 : 660750-902
MW < 25 kDa
300Extend-C18

4.6 x 150 mm、3.5µm
部品番号 : 763973-902
その他のメソッド開発方法
逆相LC/MSメソッドを用いたタンパク質およびペプチドの分離