タンパク質とペプチドのメソッド開発

300SB カラムは、TFA を含む移動相でも寿命がきわめて長いワイドポアカラムです。こうした特徴により、ペプチドやタンパク質の分離に理想的なカラムとなっています。

• 中度の疎水性を持つ C8 は、初期結合相として最適です。
• C18 と C8 は通常、ペプチドやタンパク質消化物に用いられますが、タンパク質にも使用できます。
• C3、C4、CN は通常、大型で疎水性のポリペプチドやタンパク質に用いられますが、ペプチドにも使用できます。

Poroshell 300SB カラムには、タンパク質の高速分離を可能にする革新的な粒子技術が採用されています。Poroshell カラムを使えば、短い分析時間で、高いピーク効率を簡単に得ることができます。また、300SB 結合相の使用により、TFA を含む移動相でも寿命がきわめて長くなっています。

• C18 は、初期結合相として最適で、ほとんどのペプチド、ポリペプチド、タンパク質で最大限の保持力を発揮します。
• C8 は通常、中型のタンパク質に用いられますが、すべてのサンプルに使用できます。
• C3 は通常、抗体や大型のタンパク質の分析に用いられますが、すべてのサンプルに使用できます。

カラム ： 300SB-C8
4.6 x 150 mm、3.5 または 5µm
部品番号 ： 883995-906
部品番号 ： 863973-906

移動相 ：
A ： 95% H₂O ： 5% ACN、0.1% TFA含有
B ： 5% H₂O ： 95% ACN、0.085% TFA含有

グラジエント ： 60分で0 – 60% B
温度 ： 35 - 40ºC
流速 ： 1 mL/min

カラム ： Poroshell 300SB-C18
2.1 x 75mm、5µm
部品番号 ： 660750-902

移動相 ：
A ： 95% H₂O ： 5% ACN、0.1% TFA含有
B ： 5% H₂O：95% ACN、0.085% TFA含有

グラジエント ： 10分で0 – 60% B
温度 ： 35 - 40ºC
流速 ： 2 mL/min

シンプルな水/有機溶媒グラジエント条件を用いて、低pHでスタートする

一般に、すべての目的化合物の溶出には、0.1% TFA を含む水/アセトニトリルのグラジエントが用いられます。300Å ポアサイズカラムにおける一般的な高分離能グラジエントは、30分から 60分を要します。Poroshell カラムでは、分析時間が短く、流速が速くなりますが、優れた分離能は維持されます。その後、分離能を向上するためには、グラジエント時間を延ばす、カラム長を短くする、流速を上げるなどの変更を行なってください。

サンプルの溶解度を最適化する

すべての pH で最良のピーク形状や回収率を得るためには、サンプルを完全に溶解できるようにすることが重要です。ZORBAX 300StableBond と Poroshell 300SB では、強酸性溶媒と中性溶媒を使用できます。ZORBAX 300Extend-C18 では、中性溶媒と希塩基性溶媒を使用できます。

移動相のpHを最適化する
低pHで分離が出来ない場合は、中pHや高pHを試してみる

最適化した低 pH メソッドで思うように分離ができない場合は、中 pH または高 pH の移動相を使用してください。高 pH では多くの場合、酸性アミノ酸が負の電荷を帯び、一部の塩基性アミノ酸が電荷を失うため、選択性が大きく変化します。中 pH から高 pH での分離には、ZORBAX 300Extend-C18 が最適です。

カラム ： 300Extend-C18、4.6 x 150 mm、5 mm
部品番号 ： 773995-902

移動相 ：
A ： 20 mM NH₄OH を含む H₂O
B ： 20 mM NH₄OH を含む 80% ACN

流速： 1 mL/min
温度： 25 - 30ºC （60ºCを越えないこと）
グラジエント： 30分で5 – 60% B