Agilent AdvanceBio SEC カラムによる
mAb と ADC の高速ハイスループットサイズ排除
クロマトグラフィーの実現

タンパク質は、pH、温度、または濃度の変化などのストレス条件にさらされるとしばしば凝集します。そのため、アップストリーム、ダウンストリームなどの製造プロセスの多くの異なる段階や保管中に凝集が発生する可能性があります。

サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) は、モノクローナル抗体や抗体薬の複合体 (ADC) の凝集体のモニタリングや特性解析に最適な手法の 1 つです。しかし、サイズ排除クロマトグラフィーは通常、大型のカラムを用いて比較的低い流量で実行されるため、分析時間がしばしば長くなります。

この課題を克服する選択肢となるもう 1 つの手法として、2 µm 未満のカラムを用いた超高性能液体クロマトグラフィー (UHPLC) があり、分析時間を大幅に短縮できます。しかし、微粒子や高流量を適用する場合、熱的力およびせん断力が温度や圧力に敏感なタンパク質に重大な影響を与える可能性があります。[1]

免疫原性の可能性があるため、遺伝子組み換えタンパク質の生産中は凝集レベルの完全な制御が必要です。この記事では、mAb と ADC の高速ハイスループット SEC 分析のための短く内径の小さい Agilent AdvanceBio SEC カラムのアプリケーションをご紹介します。

図 1. Agilent AdvanceBio SEC、300Å、7.8 x 150 mm、2.7 µm カラムによる未変性のリツキシマブ先発薬およびバイオシミラー、ハーセプチン、ADC の SEC クロマトグラフィープロファイル。

図 1. Agilent AdvanceBio SEC、300Å、7.8 x 150 mm、2.7 µm カラムによる未変性のリツキシマブ先発薬およびバイオシミラー、ハーセプチン、ADC の SEC クロマトグラフィープロファイル。

図 2. Agilent AdvanceBio SEC、300Å、4.6 x 150 mm、2.7 µm カラムによる未変性のリツキシマブ先発薬およびバイオシミラー、ハーセプチン、ADC の SEC クロマトグラフィープロファイル。

図 2. Agilent AdvanceBio SEC、300Å、4.6 x 150 mm、2.7 µm カラムによる未変性のリツキシマブ先発薬およびバイオシミラー、ハーセプチン、ADC の SEC クロマトグラフィープロファイル。

カラム長を短くし流量を増やして SEC の高速化を実現

このアプリケーションの目的は、分析時間を短縮して分析のスループットを向上させることでした。所定のカラム寸法の SEC の分析時間は流量の影響力を受けます。しかし、流量を増やすと、分離能を低下させることがあります。高速分析を実現するには、流量に対するカラムのボイドボリュームの比を低くする必要があります。

カラム長の短縮化と流量の増大が SEC 高速化の最も直接的な方法です。[2、3] リツキシマブのバイオシミラーと先発品、ハーセプチン、ADC を Agilent AdvanceBio SEC、7.8 x 150 mm カラムで分離しました。図 1 に示すプロファイルからクロマトグラフィー条件下で単量体が 4 分以内に適切に溶出されていることがわかります。

感度を高めるために、AdvanceBio SEC、4.6 × 150 mm カラムで分離しました。このカラムでも、図 2 に示すように優れた分離性能が得られました。どちらのカラムでも、分析初期にまたは終了前に溶出ピークが存在しないことから、市販の mAb 調合液は凝集体や分解物がない均一な状態であったことが示されました。

両方のカラムで水性移動相を用いて疎水性の ADC を分析した結果、対称のピークが得られ、疎水性ペイロードと固定相との二次相互作用がなかったことが示されました。

AdvanceBio SEC が正確な特性解析と優れたピーク形状を実現

SEC は、タンパク質凝集体のきわめて正確な特性解析を得るために広く使用されています。ここで紹介した実験では、長さが短く内径の小さい Agilent AdvanceBioSEC カラムに 2.7 µm 粒子を充填して使用し、単量体、凝集体、フラグメントのハイスループット分離を 4 分以内で実現しました。AdvanceBio SEC カラムにより、疎水性 ADC の分離を優れたピーク形状で実現できました。

面積とリテンションタイムの精度が優れ、ルーチン分析に適したメソッドの信頼性が実証されました。さらに、長さがより短く内径がより小さい Agilent AdvanceBio SEC カラムを使用することで、凝集体とフラグメントを確実にモニタリングできました。これは、ハイスループットと高い感度が必要とされるカラムの適合性を求めるために強制的にストレスを与えた試験により実証されました。

短くて内径の小さい Agilent AdvanceBio SEC カラムによる mAb および ADC の高速でハイスループットな SEC 分析の詳細については、アジレントのアプリケーションノート (5991-7165EN) を参照してください。

参考文献

1. Szabolcs Fekete, Alain Beck, Jean-Luc Veuthey and Davy Guillarme,  “Theory and practice of size exclusion chromatography for the analysis of protein aggregates”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 101 (2014) 161–173
2. S. Park, H. Cho, Y. Kim, S. Ahn, T. Chang, “Fast size exclusion chromatography at high temperature”, J. Chromatogr. A 1157 (2007) 96–100.)
3. Andrew Coffey, “Fast, High-Resolution Size Exclusion Chromatography of Aggregates in Biotherapeutics”, Agilent Application note, 5991-6458EN, December 11, 2015.