Access Agilent 2014年11月号

新しいアジレントバイオカラム AdvnceBio RP-mAbカラムは、 mAb 分析において速度、分離能、リカバリ、効率、 および再現性がすべて向上

Wu Chen
アジレント R&D シニアケミスト

Anne Mack
アジレント BioHPLC アプリケーションケミスト

Stephen Luke
アジレント LC カラムプロダクトマネージャ

モノクローナル抗体 (mAb) 医薬品は、今年、さまざまなニュース記事に登場しましたが、特に、エボラウイルスの外側にある糖タンパク質に対する人工的な免疫反応を作成するために、3 種類の抗体を混合した ZMapp を実験的に使用したというニュースは注目に値します。

高速液体クロマトグラフィー (HPLC) および超高速液体クロマトグラフィー (UHPLC) システムは、一般に、mAb 生物製剤の創薬と開発に使用されます。この注目分野での発展に貢献するため、アジレントはインタクトモノクローナル抗体と還元モノクローナル抗体の分析を高速化し、分離能やリカバリ、効率を高めるように設計された AdvanceBio RP-mAb LC カラムの新しいファミリーを開発しました。

AdvanceBio RP-mAb カラムは、Agilent Poroshell 技術をベースに、ポア径 450Å の表面多孔質 3.5 µm シリカ粒子を採用しています。これは、タンパク質と mAb の分離において表面多孔質粒子で使用できる最大のポアサイズです。0.25 µm の多孔質層は、多層化処理ではなく、1 回のステップで形成されます。これにより、卓越したバッチ間再現性を持つ極めて均一な粒子が提供されます。インタクトモノクローナル抗体と還元モノクローナル抗体の逆相分離用に特別に設計されたこの独特な粒子は StableBond C8、C4、および ジフェニル 結合相のラインナップで、真の分離能力を提供します。

IgG2 の高い分離能 (Agilent AdvanceBio RP-mAb C4、2.1 x 100 mm、3.5 µm カラム使用)

図 1. IgG2 の高い分離能 (Agilent AdvanceBio RP-mAb C4、2.1 x 100 mm、3.5 µm カラム使用)(図を拡大)

IgG2 の高い分離能 (Agilent AdvanceBio RP-mAb C4、2.1 x 100 mm、3.5 µm カラム使用)
 

条件

移動相

A: 0.1% TFA 水溶液、B: 0.1% TFA アセトニトリル溶液

流量

1.0 mL/min

グラジエント

8 分で 32~38% B

温度

85 °C

注入量

IgG2 Lambda 5 µL (Sigma I5279-1MG)

検出

215 nm

図 1. IgG2 の高い分離能 (Agilent AdvanceBio RP-mAb C4、2.1 x 100 mm、3.5 µm カラム使用)

全多孔質 300Ǻ カラムと比べ、AdvanceBio RP-mAb の生み出すピークはシャープで細部まではっきりし、突出している

図 2. 全多孔質 300Ǻ カラムと比べ、AdvanceBio RP-mAb の生み出すピークはシャープで細部まではっきりし、突出している(図を拡大)

全多孔質 300Ǻ カラムと比べ、AdvanceBio RP-mAb の生み出すピークはシャープで細部まではっきりし、突出している
 

条件

カラム

2.1 x 100 mm

移動相

A: 0.1% TFA 水溶液、IPA (98:2)、B:IPA:アセトニトリル:M.P.A (70:20:10)

流量

1.0 mL/min

グラジエント

4 分で 10~58% B

温度

80 °C

注入量

1 mg/mL ヒト化再結合ハーセプチン IgG1 インタクト (Creative Biolabs) 5 µL

図 2. 全多孔質 300Ǻ カラムと比べ、AdvanceBio RP-mAb の生み出すピークはシャープで細部まではっきりし、突出している

さまざまな選択性を提供する Agilent AdvanceBio RP-mAb C4、SB-C8、および ジフェニル 相 (条件は表 1 と同じ)

図 3. さまざまな選択性を提供する Agilent AdvanceBio RP-mAb C4、SB-C8、および ジフェニル 相 (条件は表 1 と同じ)
(図を拡大)

さまざまな選択性を提供する Agilent AdvanceBio RP-mAb C4、SB-C8、および ジフェニル 相 (条件は表 1 と同じ)
 

条件

カラム

2.1 x 100 mm

移動相

A:0.1% TFA 水溶液、B:0.1% TFA アセトニトリル

流量

0.3 mL/min

グラジエント

15 分で 20~50% B

温度

60 °C

検出

220 nm

注入量

リボヌクレアーゼ A、シトクローム C、ホロ型トランスフェリン、
α-ラクタルブミン、カタラース、炭酸脱水酵素を含むタンパク質混合物 5 µL

図 3. さまざまな選択性を提供する Agilent AdvanceBio RP-mAb C4、SB-C8、および ジフェニル 相 (条件は表 1 と同じ)

高い分離能と、より高く、シャープで明確に定義されたピーク

図 1 に示すとおり、Agilent AdvanceBio RP-mAb は、タンパク質の分離用に設計された他社のカラムよりも高い分解能を実現します。

また、私たちの調査では、AdvanceBio RP-mAb は、300Å の全多孔質カラムよりも高い分離能を示しました。図 2 を見ると、ポア径 300Å の全多孔質粒子カラムと比べ、AdvanceBio RP-mAb の生み出すピークはシャープで細部まではっきりし、突出していることがわかります。

優れた再現性

Agilent Poroshell 製造プロセスは、最高の再現性で粒子を作成します。表 1 「Agilent AdvanceBio RP-mAb 3.5 µm を使ったタンパク質の分離の性能」では、10 種類のバッチの C4 カラムを示しています。これらのカラムでリテンションタイムとピーク幅の再現性が高く、%RSD がそれぞれ 1.5% 未満、7.0% 未満であることに注目してください。

タンパク質

%RSD

リテンションタイム(分)

ピーク幅

リボヌクレアーゼ A、13.7 kDa

1.20

3.14

シトクローム C、12 kDa

0.80

3.90

ホロ型トランスフェリン、80 kDa

0.39

6.42

α-ラクタルブミン、14.2 kDa

0.61

3.25

カタラース、240 kDa

0.32

4.19

炭酸脱水酵素、29 kDa

0.41

2.64

表 1. Agilent AdvanceBio RP-mAb 3.5 µm のたんぱく質の %RSD、10 種類のバッチの C4 カラム

カラムの選択肢

AdvanceBio RP-mAb カラムは選択性の異なる 3 つの充填剤が利用できるため、アプリケーションで最高の分離能が確保されるよう、メソッド開発に柔軟性をもたらします。図 3 は、充填剤の選択で分離の状態がどのように変わるかを示しています。

堅牢で高品質な HPLC および UHPLC ソリューションファミリー

AdvanceBio RP-mAb は、成長を続けるアジレントのHPLCカラムファミリーに加わった高品質 AdvanceBio カラムの最新製品で、HPLC および UHPLC を使ってモノクローナル抗体を分析します。サンプルの精製から分析まで、アジレントの生体分子カラムをワークフローへ簡単に統合し、完全で再現性のあるソリューションを実現できます。

アジレントは、お客様の液体クロマトグラフィーのニーズを満たす堅牢な最先端の製品ラインを揃えています。このような製品ラインには、サンプルパスに金属を使用しない Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC システム、UHPLC アプリケーションに最高の速度や分離能、超高感度を提供するように設計された Agilent 1290 Infinity LC があります。生体分子は複雑ですが、Agilent HPLC カラムやシステム、消耗品を使えば、構造分析は単純で簡単です。このような Biopharma ソリューションの詳細についてはこちらをご覧ください。その後、アジレントの幅広い Biopharma リソースを活用して、生物製剤の創薬や mAb の開発に対するラボの投資を最大限生かしてください。