Access Agilent 2009年8月号

Access Agilent 2009年8月 - 適切な LC および高分離能カラムを用いた自動アミノ酸分析

John Henderson
アジレント ケミスト

アミノ酸分析 (AAA) のための LC メソッドの多くは、オフラインの誘導体化ステップが必要とされますが、こうしたステップは分析のばらつきの原因になります。この記事では、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 カラムおよび Agilent LC の選択とオンライン誘導体化による、再現性の高い簡単な AAA メソッドを紹介します。

ばらつきの低減

逆相 HPLC によるアミノ酸分析は極めて広く利用されていますが、分析手順が複雑になることがあります。AAA では通常、移動相グラジエントを用いて、サンプルマトリックスに含まれる他のアミノ酸や各成分から 20 以上のアミノ酸を分離します。フローパス容量が機器によって異なるため、多くの場合、移動相グラジエントの再現には困難が伴います。また、AAA には通常、UV または蛍光検出器で検出できるようにするために、アミノ酸の化学誘導体化手順が含まれます。手動またはオフラインの誘導体化では、反応のばらつき、汚染の危険性、分析までのアミノ酸誘導体の安定性といった複数の難問が生じます。

ここでは、OPA-FMOC (o-フタルアルデヒドおよび 9-フルオレニルメチルクロロギ酸) を用いた簡単なオンライン自動誘導体化を紹介します。この誘導体化に、逆相メソッドを組み合わせました。この方法では、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 カラム、最も広く利用されている LC システムである Agilent 1200 シリーズ LC システムおよび Agilent 1200 シリーズ Rapid Resolution LC (RRLC) を用い、リニアグラジエントで行いました。このメソッドにより、複雑なアミノ酸分析を簡単にし、再現性を高くすることができます。

図 1. Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 カラムおよび Agilent LC を使用すれば、高分離能のアミノ酸分析が実現します。(画像を拡大するにはここをクリックします)

3種類の高分離能オプション

3種類の Agilent LC システム (クォータナリポンプ搭載 1200 シリーズ、バイナリポンプ搭載 1200 シリーズ、1200 シリーズ RRLC システム) について、アミノ酸メソッドを開発しました。実際には、1 種類メソッドのみを開発し、各機器で用いる分析カラムに合わせてスケーリングし、メソッドを修正しました。3種類の HPLC システムすべてにおいて、各カラム構成で同様の高分離能分析を行うことができました (図 1)。

図 1 に示す各メソッドには、それぞれの利点があります。4.6 x 250 mm、5 µm Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 カラムは、分離能が高く、もっとも近いピーク対の分離係数 (Rs) は 2.4 です。長いカラムでは分離能が高くなりますが、分析の所要時間は、再平衡を含めて 40 分となります。

2.1 x 150 mm、3.5 µm Agilent ZORBAX Rapid Resolution カラムでは、短いカラムと効率の高い小型粒子を用いることで、分離係数を 2.0 以上に保ちながら、分析時間を 5 分の 3 に短縮することができます。また、ナローボアにより溶媒の消費量が減少するという利点もあります。1 回の分析に使用する移動相は、標準の 4.6 x 250 mm カラムでは 64 mL であるのに対し、ナローボアではわずか 12 mL です。

3 つ目の 4.6 x 100 mm、1.8 µm Agilent ZORBAX Rapid Resolution High Throughput (RRHT) カラムは、分析時間をさらに短縮します。分析時間がわずか 16 分で、優れた分離能も維持されます (Rs はすべてのピークで 2.6 以上)。移動相の消費量は、分析 1 回あたり 28 mL で、4.6 x 250 mm カラムの半分未満です。サブ 2 ミクロン粒子により性能が向上しますが、高耐圧の1200 シリーズ RRLC システムが必要となります。

図 2. 9 回の連続注入の重ね表示とピーク面積の相対標準偏差 (% RSD) により、優れたメソッド再現性が示されています。(画像を拡大するにはここをクリックします)

優れた再現性

アジレントのアミノ酸プロトコルの自動プレカラム誘導体化には、オフライン誘導体化で生じがちなばらつきやミスの原因を減らし、場合によっては完全に排除できるというもう 1 つの利点があります。また、誘導体化手順も簡単になります。すべての試薬はすぐに使える状態で提供されるため、オートサンプラトレイに試薬をセットするだけで分析を開始することができます。Agilent 1200 シリーズ標準オートサンプラまたは 1200 シリーズ高性能オートサンプラ SL Plus のプログラマブル ロボット インジェクタ アームとシリンジにより、各サンプルが誘導体化され、すぐに注入されます。図 2 に示すように、注入間の再現性も優れています。

既存の Agilent LC にメソッドを導入

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 固定相は、3 種類の粒子サイズ (5、3.5、1.8 µm) および 3 種類のカラムサイズに対応できる拡張性を備えています。そのため、高分離能アミノ酸プロトコルを、Agilent 1200 シリーズ LC (または 1100 シリーズ LC) や 1200 シリーズ RRLC システムに導入することができます。分離能、分析スピード、LC モデル、移動相消費量などをもとに、適切な組み合わせを選択することが可能です。

ZORBAX Eclipse Plus C18 カラムに、信頼性の高い Agilent LC 機器と定評のある自動オンライン誘導体化を組み合わせれば、簡単で再現性の高い遊離アミノ酸の高分離能分析が実現します。詳細については、関連ポスターをご覧ください。