Easy-A High Fidelity PCR Cloning Enzyme & Master Mix [RUO]

高い正確性とTA/UAクローニング

アジレント(旧ストラタジーン)のEasy-AHigh-Fidelity PCR Cloning Enzymeは、校正機能を備えながらPCR産物のTA/UAクローニングが可能な唯一のDNAポリメラーゼで、得られたPCR産物を直接StrataClone PCR Cloning Kitや他社のT-A/U-Aベクターを用いてPCRクローニングすることができます。

これまでは、PCR産物をT-A/U-Aベクターを用いてクローニングするためには、Taqポリメラーゼか、校正機能を持つ酵素か、という選択を迫られていました。Taqは3’-末端に-dAオーバー・ハングを付加するので高い効率でのクローニングが可能ですが、比較的エラーが入りやすいという欠点があります。校正機能を持つ酵素の場合、高い正確性が期待できますが、T-A/U-Aクローニングを行う場合にはPCR後にA-付加を行う操作が必要になります。

Easy-AHigh-Fidelity PCR Cloning Enzymeにはターミナル・トランスフェラーゼ活性があるため、Taq DNAポリメラーゼと同じようにPCR産物の3’-末端に-dAオーバー・ハングが付加されます。さらに、Taqとは異なり、本酵素には3’から5’への校正機能があるので、PfuやPfuTurboと同程度の正確な増幅が可能です。本酵素で増幅したPCR産物では、他の校正機能を持つPCR酵素で必要なPCR後の-dA付加を行う操作は不要で、PCRの後でそのままクローニングすることが可能です（図1）。高効率でのPCRクローニングには、DNAトポイソメラーゼ Iを利用したStrataClone PCR Cloning Kitが便利です。

効率を下げることなく、クローニング

Easy-AHigh-Fidelity PCR Cloning EnzymeはPCR産物の3’-末端に-dAオーバー・ハングを付加するターミナルトランスフェラーゼ活性を持っています。この酵素の校正機能はターミナルランスフェラーゼ活性に影響を与えないという独自の特徴をもつので、PCR産物は Taq で増幅された場合と同様に高い効率でクローニングができます。下の表1は、Easy-AHigh-Fidelity PCR Cloning Enzymeと2つの市販されている Taq DNAポリメラーゼを用いて増幅された 250 bp から 4 kb までのフラグメントから得られたPCR産物のクローニング効率を比べています。Easy-AHigh-Fidelity PCR Cloning Enzymeで増幅したPCR産物から95%以上のクローニング効率が得られることを示しています。4.0 kbのフラグメントの場合でも、クローニング効率は Taq DNAポリメラーゼを使用して得られたものと等しく、コロニー数にも違いはありませんでした。

A-付加ステップ無しで、正確なPCRクローニングが可能

Easy-AHigh-Fidelity PCR Cloning Enzymeは 3'-5' のプルーフリーディング活性を持ち、Pfu DNAポリメラーゼ^*に匹敵する正確性を持ちます。Taq DNAポリメラーゼ^1,2と比較すると、正確性は6倍も高くなっています。報告されているエラー率をから計算すると、Taq で長さが 1.0 kb から 5.0 kb の産物を増幅・クローニングすると、クローンの 16 ～ 80 ％にはPCRが原因のエラーが含まれると推定されます。Taq をベースにしたブレンド酵素を使用すると正確性はわずかに向上しますが、T-ベクターへのクローニング効率は減少してしまいます。Easy-AHigh-Fidelity PCR Cloning Enzymeの場合は、エラーが含まれるクローンの割合はわずか 2.6～13％まで低下すると期待されます。通常は校正機能のある酵素での増幅の後にTaq DNAポリメラーゼとのインキュベーションという追加のステップが行われます。このステップではチューブの開閉が必要で、手間がかかる上にコンタミネーションの原因にもなり得ます。Easy-AHigh-Fidelity PCR Cloning EnzymeはいかなるPCR後の A-付加ステップも必要ありません。したがって、クローニング効率・ハイスループットを犠牲にせずにPCR産物をTA/UAクローニングすることが可能です。

高い特異性を伴った力強い増幅

Easy-AHigh-Fidelity PCR Cloning Enzymeは抗体をベースとした "ホット スタート" 仕様で提供していますので、室温で反応のセットアップが可能なだけだはなく、PCRの感度を上げ、多様な鋳型から良好な結果を得ることができます。この酵素のポリメラーゼ活性、エキソヌクレアーゼ活性ともに室温ではまったくありませんが、最初の変性ステップの後に完全に活性化されます。Easy-AHigh-Fidelity PCR Cloning EnzymeはゲノムDNA、プラスミドDNAのいずれをテンプレートにした場合でも、5 kb までの長さの増幅産物を豊富な収量で産出可能です。

Easy-AHigh-Fidelity PCR マスターミックス

Easy-AHigh-Fidelity PCRマスターミックスはEasy-AHigh-Fidelity PCR Cloning Enzyme、最適化された反応バッファー、MgCl₂、dNTPがすべて含まれた2Xのマスターミックスです。Easy-AHigh-Fidelity PCR マスターミックスを使うことで、貴重な時間を節約し、スループットを向上させるだけではなく、余分なピペッティングのステップを減らすことで、クロス‐コンタミネーションを最小限に抑えることができます。また、このマスターミックスはサンプル間での再現性が高く、Easy-AHigh-Fidelity PCR Cloning Enzymeの正確さと高いクローニング効率が最大限に発揮されます

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Figure 1 How Easy-A PCR Cloning Enzyme Works

Table 1: The Easy-A High-Fidelity PCR Cloning Enzyme Delivers High Cloning Efficiencies PCR amplification products of various sizes were generated with the Easy-A high-fidelity PCR cloning enzyme, Taq2000 and Platinum Taq DNA polymerases and cloned using the TOPO TA Cloning kit. The “percent recombinants” value equals the number of white colonies obtained/total colony number. NT = not tested

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Easy-A High-Fidelity PCR Master Mix, 100 rxn 600640 100 rxns お問い合わせください Call 2x master mix format of Easy-A high-fidelity PCR cloning enzyme Easy-A High-Fidelity PCR Cloning Enzyme, Reaction Buffer, MgCl2, dNTPs 分析保証書 (C of A)　　 マニュアル
Easy-A High-Fidelity PCR Master Mix, 400 rxn 600642 400 rxns お問い合わせください Call 2x master mix format of Easy-A high-fidelity PCR cloning enzyme Easy-A High Fidelity PCR Cloning Enzyme, Reaction Buffer, MgCl2, dNTPs 分析保証書 (C of A)　　 マニュアル